ICS 65.020.01 B 21 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2391—2015 “三系”杂交大豆种子纯度鉴定 DNA 分析 方法(SSR) Assessment of the purity of "three-line" hybrid soybean -DNA analysis method (SSR) 2015 - 12 - 15 发布 吉林省质量技术监督局 2016 - 01 - 25 实施 发 布 DB22/T 2391—2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院。 本标准主要起草人：张春宝、彭宝、赵丽梅、张伟龙、张伟、张井勇、闫昊、赵鑫。 I DB22/T 2391—2015 "三系"杂交大豆种子纯度鉴定 DNA 标记分析方法（SSR） 1 范围 本标准规定了“三系”杂交大豆种子纯度鉴定SSR标记分析方法的原理、纯度检测程序、结果计算 及结果报告。 本标准适用于“三系”杂交大豆品种的纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.1 农作物种子检验规程 总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 NY/T 1788 大豆品种纯度鉴定技术规程SSR分子标记法 DB22/ 2209 杂交大豆种子 3 术语与定义 DB22/ 2209界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了DB22/ 2209 中的一些术语和定义。 3.1 雄性不育系 cytoplasm male sterility line 雄蕊发育退化或败育，不能产生有功能的花粉，但它的雌蕊发育正常，能接受正常花粉而受精结实， 并能将雄性不育性遗传给后代的品系。 3.2 保持系 maintainer line 保持系可以保持不育系的不育特性，保持系和不育系杂交，当代可以结实，但是子代仍然是不育系， 可以让不育系得到繁殖，保有不育系材料。 3.3 恢复系 restorer line 常规大豆品种，它的特殊功能是用它的花粉授给不育系，所产生的杂交种育性恢复正常，能自交结 实，如果该杂交种有优势，可用于生产。 3.4 三系 three line 雄性不育系、保持系和恢复系三系配套育种，不育系为生产大量杂交种子提供了可能性，借助保持 系来繁殖不育系，用恢复系给不育系授粉来生产育性恢复且有优势的杂交种。 3.5 1 DB22/T 2391—2015 杂交大豆 hybrid soybean 用不育系作母本与恢复系杂交，得到的 F1 种子。 4 原理 简单序列重复（simple sequence repeats，SSR）是由几个核苷酸为重复单元的长达几十至几百个 核苷酸的串联重复序列；由于基本单元重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性；根据SSR座位两侧保 守的单拷贝序列设计一对特异引物来扩增SSR序列，即可揭示其多态性。SSR标记具有共显性的特点，鉴 于母本不育系和父本恢复系在恢复基因的特征连锁区域存在差异，而F1杂交种子具有双亲等位基因的互 补带型，据此特征选择恢复基因连锁SSR标记进行分析，可用于区分杂交种和伪杂种。 5 纯度检测程序 5.1 取样 5.1.1 应按 GB/T 3543.2 的规定扦样，从供试样品中随机选取 100 粒种子。 5.1.2 应按 GB/T 3543.4 规定的方法进行发芽，随机选取其中不少于 50 株幼苗；也可从 5.1.1 中直 接选取不少于 50 粒干种子。 5.2 引物确定 根据不同杂交种品种特异性从14 对SSR引物（见附录A）中选取3 对作为测试引物。 5.3 试验方法 5.3.1 DNA 提取 以幼苗为供检测样品，需称取50 mg叶片放入2 ml离心管中，加液氮用玻璃棒研磨至粉末状；以干 种子为供检测样品，需单粒研磨成粉，称取50 mg豆粉放入2 ml离心管中。以上样品DNA提取，应按NY/T 1788 执行。 5.3.2 PCR 扩增 5.3.2.1 PCR 反应体系 反应体系包括1×PCR 缓冲液；4种dNTPs混合物0.2 mmol/L；正、反向引物各0.15 μmol/L； Taq DNA 聚合酶1 U；待测样品DNA 20 ng，加双蒸水补足至25 μL。 5.3.2.2 PCR 反应程序 94 ℃ 预变性4 min；然后94 ℃ 变性30 s，46 ℃～55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，运行30 个循环；最后72 ℃ 10 min，4 ℃ 条件下保存。 5.3.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 应按NY/T 1788的规定执行。 6 结果计算 2 DB22/T 2391—2015 杂交种纯度（P）按公式1计算： P= NT − N F × 100 (1) NT 式中： P——杂交种纯度以%表示； NT——供检种子数量，单位为粒； NF——判定为伪杂交种子数量，单位为粒。 7 结果报告 应按 GB/T 3543.1 的规定执行。 3 DB22/T 2391—2015 AA 附 录 A （规范性附录） 用于“三系”杂交大豆种子鉴定的 SSR 分子标记引物 用于“三系”杂交大豆种子鉴定的SSR分子标记引物见表A.1。 表A.1 核心引物名称 用于“三系”杂交大豆种子鉴定的 SSR 分子标记引物 正向引物序列（5’-3’） 反向引物序列（5’-3’） 适用杂交大豆品种 GCGCATTAAGGCATAAAAA GCACAATGACAATCACATA 杂交豆3号，杂交豆5号，吉 AGGATA CA 育607，吉育608，吉育609 TTTAGAGACCTACTTAAAG CATCGACCAAGTCAACGCT 杂交豆3号，杂交豆5号，吉 CACCTCA A 育606，吉育608，吉育609 BARCSOYSSR_16_1052 TTTAGAGACCTACTTAAAGCACCTCA CATCGACCAAGTCAACGCTA BARCSOYSSR_16_1060 AGCCTCACATGTCCTCCTCT ATTGTAAGGCCCAGGTTTTT BARCSOYSSR_16_1073 CTCCGTTGCTGAT TAAGCTGAATTAGTAAAA BARCSOYSSR_16_0703 BARCSOYSSR_16_1052 杂交豆1号，杂交豆3号，杂 交豆4号，吉育607 杂交豆1号，杂交豆3号，杂 交豆4号，吉育607，吉育608 杂交豆1号，杂交豆2号，杂 交豆3号，杂交豆4号，吉育 606，吉育607，吉育609 杂交豆 1 号，杂交豆 2 号， BARCSOYSSR_16_1075 BARCSOYSSR_16_1087 CCCCAAACAATGGACAACA CGTTAAGATTTTTACATTAT 杂交豆 3 号，吉育 608，吉 T CAACGAA 育 609 TTGTTCCTTACTTGGGCAAA 吉育 606，吉育 608 CACCCTTCATCTCACTGCA A 杂交豆 1 号，杂交豆 2 号， BARCSOYSSR_16_1095 CACCAATTTAAAGTTTGAT TCCCACCACTTATTGGTTTC 杂交豆 3 号，杂交豆 4 号， GGTC A 杂交豆 5 号，吉育 606，吉 育 607，吉育 609 4 DB22/T 2391—2015 表A.1 (续) 核心引物名称 正向引物序列（5’-3’） 反向引物序列（5’-3’） 适用杂交大豆品种 BARCSOYSSR_16_1097 GTTGCAATTGTCAGCATCG GAGTCGGTTAACAACGGAA T A TTGCTTGTGACTCGAGAAA CGTGATTGCATATGACTGTT 杂交豆 4 号，吉育 606，吉 A CA 育 609 BARCSOYSSR_16_1 AAAAGAAGGAGGCACGTC AGGATGTGCTTGACGGAAC 交豆5号，吉育606，吉育607， 110 AT T 吉育608，吉育609 BARCSOYSSR_16_1 AGAAAAGAAATATATTCCC ACAATGTTAAAGTCATCCA 交豆4号，杂交豆5号，吉育 123 CAGATAA ATTATACA 607 BARCSOYSSR_16_1 TGGAGTTATGGTAACAGTG CATGTTTGTACTTGGTGCAT 交豆4号，杂交豆5号，吉育 124 ATGCT GA 606，吉育607 BARCSOYSSR_16_1 GCGCTATCCGATCCATATG TGATTTCGCTAGGTAAAATC 杂交豆2号，杂交豆4号，杂 165 TG A 交豆5号，吉育606，吉育608 杂交豆 5 号，吉育 609 杂交豆 1 号，杂交豆 3 号， BARCSOYSSR_16_1102 杂交豆3号，杂交豆4号，杂 杂交豆1号，杂交豆2号，杂 杂交豆1号，杂交豆3号，杂 _________________________________ 5