ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 0 13-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品原料 皮肤致敏试验 -直接多肽结合 试验（ DPRA） Cosmetic Ingredients Skin Sensitisation Test - Direct Peptide Reactivi ty Assay (DPRA) 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.规范性引用文件 ……………………………………………………… …………… ……… 3 3.术语和定义 …………………… …………………………………………………………… 3 4.基本原理………………………………………………………… ………………… ……… 3 5.仪器和试剂耗材 ………………………………… ………… ………………………… …… 3 6.试验方法 ………………………………………………………………………………… … 4 7.试验成立条件 ……………………………………………………………………………… 6 8. DPRA预测模型 ……………………… …………………………………………………… . 6 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 上海出入境检验检疫动植物与食品检验检疫技术中心、 上海家化联合股份有限公 司、伽蓝（集团）股份有限公司、 上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化有限公司 、上海市 质量监督检验技术研究院 、玫琳凯（中国） 有限公司、上海天 祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物 科技有限公司 有限公司、 汉高（中国）投资有限公司、 广东博溪生物科技有限公司、 东阿阿胶股份有限 公司、上海日用化学品行业协会 。 本标准主要起草人： 丁诗璇、卞俐娜、张丽婷 、陈田、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 戴彦韵、 万向红、李琼、高宏旗 、金坚、陈亦华 3 化妆品原料皮肤致敏体外替代试验 ——直接多肽结合试验 (DPRA) 1 范围 本标准规定了化妆品原料皮肤致敏直接多肽结合试验方法。 本标准适用单一组分或已知组成成分混合物的化妆品原料的潜在皮肤致敏性评价。 本标准可作为皮肤致敏性动物试验的 替代方法之一。可以结合其他皮肤致敏替代试验，对皮肤致敏 反应进行综合评价。 本标准可作为其他领域皮肤致敏体外测试的参考方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 OECD. Test No. 442C: In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay(DPRA) 3 术语和定义 下列术语和定义适用于 本文件。 3.1 皮肤致敏 skin sensitization 是皮肤对一种物质产生的免疫原性皮肤反应。 3.2 多肽消耗率 percent peptide depletion 多肽消耗率 =［１－（样品多肽峰面积均值／ 空白对照多肽峰面积均值 ）］×100% 4 原理 本试验使用化学方法模拟致敏物质与 合成半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽 的结合， 运用高效液相色谱测 定两种多肽的消耗情况，根据多肽消耗率来预测受试物的皮肤致敏能力。 5 仪器与试剂耗材 5.1 试剂 5.1.1 多肽片段 半胱氨酸多肽（ Ac-RFAACAA -COOH，分子量 751.9，纯度 >90%） 赖氨酸多肽（ Ac-RFAAKAA -COOH，分子量 776.2，纯度 >90%） 5.1.2 乙腈（色谱级） 5.1.3 水，为 GB/T 6682 规定的一级水 5.1.4 三氟乙酸（分析纯） 5.1.5 二水合磷酸二氢钠（分析纯） 5.1.6 十二水合磷酸氢二钠（分析纯） 4 5.1.7 乙酸铵（分析纯） 5.1.8 氨水（分析纯） 5.1.9 肉桂醛（分析纯） 5.2 仪器 5.2.1 高效液相色谱仪 5.2.2 色谱柱 C18柱（ 2.1mm× 100mm× 3.5micron ）或等效色谱柱 6 试验方法 6.1 多肽贮备液的配制 6.1.1 半胱氨酸多肽贮备液：称取适量半胱氨酸多肽，用 pH7.5的磷酸盐缓冲液配制成 0.667 mmol· L -1的溶液。 PH7.5磷酸盐缓冲液：将 18mL 0.1mmol· L-1磷酸二氢钠溶液与 82mL 0.1 mmol· L-1磷酸氢二钠溶液混 合，调节 PH至7.5。 6.1.2 赖氨酸多肽贮备液：称取适量赖氨酸多肽，用 pH10.2的乙酸铵缓冲液配制成 0.667mmol·L -1 的溶液。 pH10.2乙酸铵缓冲液：取乙酸铵 1.542g，加水 200mL溶解，用氨水调节 pH值至 10.2。 6.2 受试物及阳性对照溶液的配制 试验当天配制受试物和阳性对照溶液，浓度为 100mmol· L-1，体积 3mL，阳性对照为肉桂 醛。溶剂 首选乙腈， 若不溶解， 可尝试溶解于水、 水 /乙腈 (1:1)、 异丙醇、 丙酮、 丙酮 /乙腈 (1:1)， 也可溶解于 300μL 二甲基亚砜后用 2700μL乙腈稀释，或用 1500μL二甲基亚砜溶解后用 1500μL乙腈稀释。 6.3 多肽标准溶液的配制 将8mL磷酸盐缓冲液和 8mL乙酸铵缓冲液分别与 2mL乙腈混合配制成稀释缓冲液。取 1600μL 0.667mmol· L-1多肽贮备液 （ 0.667 mmol· L-1） 加入到 400μL乙腈中配制成多肽标准母液 （ 0.534 mmol· L-1）。 将多肽标准母液与稀释缓冲液等比例稀释混合配 制成浓度为 0.534mmol· L-1、0.267mmol· L-1、 0.1335mmol· L-1、0.0667mmol· L-1、0.0334mmol· L-1、0.0167mmol· L-1、0 mmol· L-1的多肽标准溶液。 6.4 高效液相色谱测试溶液的制备 取1mL进样瓶，按表 1加入试剂，混匀，每个样品、对照均平行制备 3份。将进样瓶置 25± 2.5℃ 下避光孵育 24± 2h后分别用高效液相色谱进行检测，并在 30小时内完成全部检测。反应前后需对进样 瓶进行观察并记录是否出现沉淀等情况。当孵育前出现沉淀，则多肽消耗量无法计算，阳性结果可用， 阴性结果不确定；若仅孵育后出现沉淀，则采用 100-400xg低转速离心，使沉淀集聚至进样瓶底部，再 进样。 表1 空白对照、共洗脱对照及样品配制表 1:10比例 半胱氨酸多肽 0.5 mmol· L-1多肽， 5 mmol· L-1受试物 1:50比例 赖氨酸多肽 0.5 mmol· L-1多肽， 25 mmol· L-1受试物 750μL 半胱氨酸多肽贮备液 （共洗脱对照用 pH7.5磷酸盐缓冲 液） 750μL赖氨酸多肽贮备液 5 （共洗脱对照用 pH10.2乙酸铵缓冲液） 50μL受试物溶液（空白对照用乙腈；溶剂对照用溶剂） 250μL受试物溶液（空白对照用乙腈；溶剂对照用溶剂） 200μL乙腈 6.5 高效液相色谱检测 6.5.1 流动相 流动相 A：1L水中加入 1000μL三氟乙酸。 流动相 B：1L乙腈中加入 850μL三氟乙酸。 6.5.2 高效液相色谱条件 C18色谱柱，柱温 25℃,进样量 3-10μL，于 220nm处检测多肽的峰面积。色谱洗脱条件见表 2（根 据情况可做适当调整） 。 表2 高效液相色谱梯度洗脱条件 时间 /min 流速 / mL· min-1 流动相 A/% 流动相 B/% 0 0.35 90 10 10 0.35 75 25 11 0.35 10 90 13 0.35 10 90 13.5 0.35 90 10 20 0.35 90 10 6.5.3 高效液相色谱进样序列 表3 高效液相色谱进样序列（可供参考） 标准溶液和空白对照 标准溶液 1 标准溶液 2 标准溶液 3 标准溶液 4 标准溶液 5 标准溶液 6 稀释缓冲液 空白对照 A平行 1 空白对照 A平行 2 空白对照 A平行 3 共洗脱对照 样品 1共洗脱对照 样品 2共洗脱对照 样品