ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 0 15-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验 方法 Cosmetics -Tyrosinase Activity Inhibition Test Method 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.原理……………………………………………………………… …………… …………… 3 3.仪器…………………………………………………………………… …………… ……… 3 4.试剂…………… …………………………………………………… ………………… …… 3 5 实验方法 ……………………………………………… ………… ………………………… 3 6.结果计算 ……………………………………………… …………………………………… 4 7.试验有效性验证 ………………………………………… ………………………………… 4 8.结果报告 ………………………………………… ………………………………………… 5 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位：上海家化联合股份有限公司、 东阿阿胶股份有限公司、 伽蓝（集团）股份有限公 司、上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化 有限公司、 上海市质量监督检验技术研究院 、玫 琳凯（中国） 有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物科技有限公司 、汉高中国（投 资）有限公司、广东博溪生物科技有限公司、 上海日用化学品行业协会 。 本标准主要起草人： 陈媛祺、 陈志涛、范倩文、廖峰、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 周泽琳、 万向红、李琼、高宏旗 、金坚、陈亦华 3 化妆品-酪氨酸酶活性 抑制实验方法 1．范围 本标准规定了 酪氨酸酶活性抑制实验 的基本技术要求。 提供一种美白原料的评估方法，适用于宣称通过 抑制酪氨酸酶活性而达到美白效果的 水溶性原料的功效评价。 2.原理 在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最 后形成黑色素。酪氨酸酶在 pH6.8的磷酸溶液中，可催化多巴转化成多巴醌，在 分光光度计 475nm处可测 定吸光值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的原料可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据 吸光 值的变化，评估原料对酪氨酸酶 活性的抑制作用。 3.仪器 分析天平 ：感量 0.1mg； 试管：10mL； 可调节移液枪： 1.00mL； 紫外可见分光光度计 。 4.试剂 除有另外说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 Na2HPO4·12H2O； 一水合柠檬酸 ； pH6.8的磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液 ① 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O：14.33g溶于200mL水，用玻棒搅拌至溶解 ； ② 0.1 mol/L 一水合柠檬酸： 2.1g 溶于100mL水，用玻棒搅拌至溶解 ； ③ pH6.8 磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液： 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 154.5 mL ，加入0.1 mol/L 一水合柠 檬酸45.5 mL，配制成 200mL的磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液； 酪氨酸酶 ，活力≥1000unit/mg固体； 左旋多巴， 纯度≥98%； 酪氨酸酶溶液：用 pH6.8磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液配制， 100u/mL，临用配制； 左旋多巴溶液 ：用pH6.8磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液配制， 1mg/mL，避光保存 ； 阳性对照：曲酸， 纯度≥98.5% 5.实验方法 4 阳性对照物用 pH6.8磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液 稀释成：1mg/mL、0.2mg/mL、0.04mg/mL、0.008mg/mL 系列浓度梯度用以验证试验系统。 受试物处理：受试物用磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液 稀释为多级浓度样品 。 参照表1，使用10mL试管设立样品管（ T）、样品 本底（T0）、酶反应管 （C）和溶剂本底 （C0），每一 样品的每个受试浓度 的样品管（ T）需设立 3支平行管，同时酶反应管 （C）也需设立3支平行管。 在样品管（T）和样品本底 （T0）中各加入 1mL相同浓度的样品溶液，酶反应管（ C）和溶剂 本底 （C0）则分别加入 1mL磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液 。 在样品管 （T）和酶反应管 （C）中各加入 0.5mL酪氨酸酶溶液， 样品本底（T0）与溶剂本底 （C0）以0.5mL 磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液代替 ，将样品和酪氨酸酶充分混匀，置 37℃水浴槽孵育 10分钟。 依次在各管中加入 2mL的左旋多巴 溶液，控制每管反应时间 为5分钟，即刻将各管反应溶液移入比色皿 中，在475nm处测定吸光值 。 表1 样品加液要求 T-样品管 T0-样品本底 C-DPPH管 C0-溶剂本底 样品溶液（ mL） 1 1 — — 磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液 （mL） — 0.5 1 1.5 酪氨酸酶溶液（ mL） 0.5 — 0.5 — 左旋多巴溶液 （mL） 2 2 2 2 平行次数 3/样 1/样 3/试验 1/试验 6.结果计算 计算酪氨酸酶抑制率： %100)T-T-1（）% 抑制率（ 00CC …………………………（ 1） （1）式中： T—样品管吸光值，即样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值； T0—样品本底 吸光值； C—酶反应管 吸光值3次平均值，即未加样品时酪氨酸 酶和多巴反应的 吸光值； C0—溶剂本底 吸光值。 7.试验有效性 验证 每批次实验都需要加入阳性对照的测试，阳性对照 曲酸的IC50（达到50%抑制效果时对应的样品受 试浓度） 应在0.05mg/mL-0.15mg/mL，则认为试验系统有效 。 5 根据公式 （1）计算样品在各受试浓度下的 酪氨酸酶抑制 率，同时统计 各组平行管间抑制率间的标 准差（Standard Deviation ，SD），SD值须≤3%，则认为试验平行性有效。 8. 结果报告 样品在某一受试 浓度下的 对酪氨酸酶的 抑制率应表述为：抑制率平均值 ±抑制率间的标准差 （SD）。 对于样品抑制酪氨酸酶 活性的表述， 不应脱离受试浓度 而言。 在进行样品间抑制酪氨酸酶活性的比较时 ，绘制样品受试浓度与酪氨酸酶 抑制率的浓度 反应关系曲线， 应用拟合公式 （ R2≥0.9）计算各样品的IC50，IC50越小代表活性越强。 _________________________________