! 7 ,     江苏省市场监督管理局 发 布 中 国 标 准 出 版 社 出 版猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测 技术规范 Technical specifications of cellular immunoassays for porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2025 ‑10‑30发布 2025 ‑11‑30实施CCS B 41ICS 11. DB32/T 5245 —2025220DB32/T 5245 —2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由江苏省农业农村厅提出并组织实施 。 本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口 。 本文件起草单位 ：江苏立华食品集团股份有限公司 、江苏省农业科学院 、立华南京农业产业研究院有 限公司。 本文件主要起草人 ：张海涛、张雪寒、罗燕、李彬、张双玉、尹丽萍、丁小燕、赵永祥、孟宪臣、杨铜、汝晓飞、 祁晓晓、汤子澈、郄博、常长琳、李昌明、武玮、韩宁宁、张泰康、许盛海。 Ⅰ猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测DB32/T 5245 —2025 技术规范 1 范围 本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒 MHC肽四聚体细胞免疫检测技术的试剂及仪器 、质量控制 和结果判定 ，描述了相应的检测方法 。 本文件适用于 SLA⁃ 1*04∶01∶01型猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测 、疫苗免疫效力评价和病 毒感染的早期诊断 ，其他基因型猪的相关检测方法可参照确立 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB/T 18090　猪繁殖与呼吸综合征诊断方法 GB 19489　实验室生物安全通用要求 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1.1 主要组织相容性复合体 major histocompatibility complex ； MHC 一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称 。 3.1.2 SLA‑1等位基因 swine leukocyte antigen ；SLA 基因座上的不同形式的基因 。 注1： SLA是猪的 MHC。 注2： SLA⁃ 1是SLA系统中的一个基因座 。 3.1.3 四聚体 tetramer 一种由四个 MHC分子单体与一条抗原肽结合后 ，再与荧光标记物连接形成的多聚体蛋白复合物 。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 APC：别藻蓝蛋白 （Allophycocyanin ） BirA：生物素连接酶 （Biotin⁃Protein Ligase A ） CTL：细胞毒性 T淋巴细胞 （Cytotoxic T Lymphocyte ） 1DMSO：二甲基亚砜 （Dimethylsµlfoxide ） FACS：流式细胞荧光分选技术 （Flµorescence Activating Cell Sorter ） FITC：异硫氰酸荧光素 （Flµorescein Isothiocyanate Isomer ） FSC：前向角散射光 （Forward Scatter ） PBS：磷酸盐缓冲液 （Phosphate Bµffered Saline ） PRRS：猪繁殖与呼吸综合征 （Porcine Reprodµctive And Respiratory Syndrome ） PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒 （Porcine Reprodµctive And Respiratory Syndrome Virµs ） PBMC ：外周血单个核细胞 （Peripheral Blood Mononµclear Cell ） R⁃PE：藻红蛋白 （R⁃Phycoerythrin ） SSC：侧向散射光 （Side Scatter ） TCR：T细胞受体 （T Cell ReceptorDB32/T 5245 —2025 ） 4 主要器材 4.1 真空抗凝管 。 4.2 5 mL或10 mL的无菌注射器 。 4.3 10 mL或15 mL的透明无菌离心管 。 4.4 一次性巴氏吸管 。 4.5 1 000 μL无菌长枪头 。 4.6 可控温水平离心机 。 4.7 流式细胞仪 。 4.8 精密可调移液器 ，1 μL~10 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL。 4.9 流式管或 1.5 mL离心管。 4.10 流式管管架或双面离心管架 。 4.11 用于覆盖 1.5 mL离心管板架或流式管的锡箔纸 ，避光用途 。 4.12 冷藏展示柜 。 4.13 细胞冻存管 。 4.14 血细胞计数板 。 4.15 倒置光学显微镜 。 5 主要试剂 5.1 除另有规定外 ，所有试剂应为分析纯 。 5.2 猪外周血单个核细胞分离液 。 5.3 无菌 PBS缓冲液，见附录 A的A.1。 5.4 细胞冻存液 ，见附录 B的B.5。 5.5 FACS洗涤液，见A.2。 5.6 无菌双蒸水 。 5.7 流式抗体 ，见A.3。 5.8 MHC四聚体（PE⁃pSLA+⁃Tetramer ，见附录 D） 。 5.9 红细胞裂解液 。 26 DB32/T 5245 —2025 检测 6.1 阴性样品制备 见附录 B。 6.2 阳性样品制备 见附录 C。 6.3 样品采集与处理 6.3.1 抗凝血采集 ，见B.2。 6.3.2 PBMC的分离见 B.3。 6.3.3 PBMC的计数，B.5。 6.3.4 PBMC的冻存，见B.5。 6.3.5 SLA⁃ 1基因型检测方法 ，见附录 E。 6.4 样品染色 6.4.1 检测试剂配置 ：按照待检测样本数量 ，参照 A.3配制染色液 ，含有 FITC mouse anti⁃pig CD 3+、 APC mouse anti⁃pig CD 8a+和PE⁃pSLA+⁃Tetramer 三种成份 。 6.4.2 细胞染色 ：使用 6.4.1配制的 FACS染色混合液重悬细胞沉淀 ，200 µL/样本，轻轻吹打混匀 ，4 ℃~ 8 ℃避光孵育 30 min~ 60 min。 6.4.3 细胞洗涤 ：将6.4.2孵育后细胞悬液 ，水平离心机 ，250 g离心 10 min，取细胞沉淀 ，用FACS洗涤 液清洗 2次，再将细胞沉淀重悬于 FACS洗涤液中 ，200 µL/样本，应在 4 h内上流式细胞仪分析 。 6.4.4 若无法及时上机 ，可使用含有工作浓度为 1%~ 2%多聚甲醛的 FACS液体固定 ，4 ℃~ 8 ℃避光 保存，并在一周内尽快完成上机检测 。 6.5 流式细胞术检测 6.5.1 设置仪器工作条件 ，包括环境温度 、湿度、电源电压 、大气压力 、环境光照等 。 6.5.2 开机后，对流式细胞仪进行清洗 、光路系统进行校验 ，应参照流式细胞仪的校验参数检测 FSC、 SSC和各荧光通道的平均荧光强度 、变异系数和荧光分辨率 。 6.5.3 应设置空白对照和单染管对照 。 6.5.4 样本依次上样 ，应设置自动清洗 、设定阈值和电压 、进行荧光补偿 。 6.5.5 与阴性样品对比 ，通过相应散点图中的荧光强度表达 ，区分出目标细胞的阳性信号并进行圈门 。 6.5.6 应在进样稳定后开始采集信号 。有效细胞信号采集数量不低于 10 000个细胞。信号采集时间不 应超过 5 min。 6.5.7 数据分析 ，使用高版本号软件 。根据 FSC/SSC 双参数获得单核淋巴细胞的百分比 ，根据 FITC⁃CD 3+/SSC双参数获得 CD3+T淋巴细胞细胞百分比 ，根据 APC⁃CD 8+/FITC⁃CD 3+双参数获得 CD3+CD8+双阳的 T淋巴细胞细胞的百分比 ，根据 APC⁃CD 8+/PE⁃pSLA+获得 CD8+/pSLA+双阳的 T 淋巴细胞的百分比 ，即抗原特异 CTL细胞的百分比 。 37 结果判定 7.1 在判定结果前应检查对照样品的结果 ，具体如下DB32/T 5245 —2025 ： ——空白对照 ，用以排除细胞自发荧光背景 ，设置最佳的 PMT电压； ——单染管对照 ，设置最佳的荧光补偿 ； ——阴性样品 ，设置圈门界限 ，CD8+/pSLA+⁃tetramer 双阳的 T淋细胞的百分比范围 0%~ 10%。 如有一标准不符合 ，结果是无效的 ，需重新检测和分析 。 7.2 结果计算 以CD8+/pSLA+⁃tetramer 双阳的 T淋巴细胞比较对象 ，阳性率按公式 （1）计算： P=S N×100% ………………………… （ 1 ） 式中： P——阳性率； S——待检测样本 CD8+/pSLA+⁃tetramer 双阳的 T淋巴细胞 ； N——阴性对照样本 CD8+/pSLA+⁃tetramer 双阳的 T淋巴细胞 。 7.3 结果判定 当P≥2时，样品为阳性 ；当P<2时，样品为阴性 。 8 临床综合判定 结合第 7章中阴阳性样品的检测结果 ，对猪群 PRRSV 的感染免疫情况进行综合判定 ，见表 1。 表1　感染免疫情况判定 基因型 SLA⁃ 1*04∶01∶01 　以上判断适用于 SLA⁃ 1*04∶01∶01基因型，配合 GP5肽段（