ICS 65.020.30 CCS B 47 四川省 地方标准 DB51/T 1185—2025 代替 DB51/T 844—2008，DB51/T 1185—2011 DB51 桑蚕微粒子病诊断防控技术规程 2025-09-15发布 2025-10-15实施 四川省市场监督管理 局 发布DB51/T 1185 —2025 I 目 次 前言 ................................ ................................ .................. II 1 范围 ................................ ................................ ................. 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ .......1 3 术语和定义 ................................ ................................ ........... 1 4 诊断技术 ................................ ................................ ............. 1 5 防控技术 ................................ ................................ ............. 5 附录A（资料性） 微粒子孢子图 ................................ .......................... 10 附录B（资料性） DNA普通提取法 ................................ ........................ 11 附录C（资料性） 荧光定量 PCR产物相关信息 ................................ .............. 12 附录D（资料性） 阳性质粒的制备 ................................ ........................ 13 DB51/T 1185 —2025 II 前 言 本文件按 照GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替 DB51/T 844 —2008《桑蚕微粒子病防治技术规程 》和DB51/T 1185 —2011《桑蚕微粒子 病诊断技术规程 》。与DB51/T 844 —2008和DB51/T 1185 —2011相比，除 结构性调整和 编辑性改动外， 主要技术变化如下： ——增加了桑叶全程消毒技术（见 5.2.5）。 ——增加了实时荧光定量 PCR检测法（见 4.2）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由四川省农业农村厅提出 、归口、解释并组织实施 。 本文件起草单位：四川省蚕业管理总站、西南大学、四川省农业科学院蚕业研究所。 本文件主要起草人： 吴钢、马露芸、潘敏慧、青学刚、董战旗、王琳璐、杨炯、李文学、魏卓娅、 王晶晶。 DB51/T 844 —2008和DB51/T 1185 —2011的历次版本发布情况为： ——DB51/T 844 于2008年首次发布； DB51/T 1185 于2011年首次发布 。 ——本次为第一次修订。 DB51/T 1185 —2025 1 桑蚕微粒子病诊断防控 技术规程 1 范围 本文件规定了 桑蚕微粒子病诊断和防控技术要求， 确立了常规诊断及实时荧光定 量PCR检测的流程 和方法，描述了防控的关键环节及防控内容。 本文件适用于四川省桑蚕 微粒子病的诊断和防控。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 1027 桑园用药技术规程 DB51/T 848 养蚕消毒技术规程 DB51/T 1187 桑蚕原蚕基地建设规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 桑蚕微粒子病 pebrine for silkworm ( Bombyx mori ) 由桑蚕微孢子虫（ Nosema bombycis Naegeli）感染引起的蚕病。 3.2 补正检查 corrective inspection for pebrine 从母蛾检疫合格的原蚕种中，逐卵圈抽取少量蚕卵 置于温度（29±0.5）℃、相对湿度 大于等于 85% 的条件下催青，对孵化蚁蚕及卵壳、死卵，或原蚕种正常收蚁后的 催青死卵 、尾蚁、卵壳等，进行微粒 子病检查。 3.3 预知检查 predictive inspection for pebrine 从饲养到制种全过程，对幼虫、蛹、成虫 ，蚕粪、熟蚕尿、蛾尿等排泄物 ，蜕皮壳、蛹壳、鳞毛等 脱出物等抽样，进行微粒子病检查。 4 诊断技术 4.1 常规诊断 4.1.1 主要仪器设备 包括： DB51/T 1185 —2025 2 ——普通光学显微镜、相衬（相差）显微镜，放大倍数 16倍×40倍； ——生化培养箱，温度范围 10 ℃～50 ℃，湿度范围 50%～95%； ——普通冰箱，温度为0 ℃～4 ℃、-20 ℃； ——电子天平，精度 0.001 g； ——离心机，转速 0 r/min～3000 r/min。 4.1.2 试剂 包括： ——氢氧化钾溶液 [w(KOH)=2％]； ——浓盐酸[w(HCl)=30 ％]; ——过氧化氢溶液 [w(H2O2)=10％]； ——乙醇溶液 [w(CH3CH2OH)=75％]； ——无菌水； ——分析用水按 GB/T 6682 规定执行。 4.1.3 耗材 包括： ——解剖剪、镊子、橡皮吸管 ； ——研钵、研磨棒 ； ——样品袋、离心管（ 1.8 mL、5 mL）； ——容量瓶、量筒、烧杯 ； ——载玻片、盖玻片 ； ——无纺布滤纸。 4.1.4 外观观察 通过肉眼观察，蚕的不同发育阶段是否具有下列症状： a) 卵期：卵形不正，排列不齐、多重叠卵 ；卵产附差、易脱落，不受精卵和死卵多；催青期发育 不整齐； b) 小蚕期：收蚁后不疏毛 ；体色深暗、体躯瘦小 ；发育缓慢、重症死亡；群体发育不齐 ； c) 大蚕期：表皮缩皱、体呈锈色；体壁出现微细不规则黑褐色病斑，以尾角末端、气门周围和胸 腹足外侧部位较多；蜕皮困难 、死亡；群体发育不齐 ； d) 蛹蛾期：蛹反应迟钝 ；表皮无光泽、腹部松弛，体壁出现微细不规则黑褐色病斑 ；感病严重的 不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鳞毛脱落 ；腹部膨大、节间松弛 ；交配能力差 ；产卵少。 4.1.5 解剖观察 将外观观察的具有上述大蚕期典型症状的病蚕 ，用解剖剪从背中线剪开，肉眼观察丝腺是否有乳白 色脓疱状斑块。 4.1.6 显微镜检查 4.1.6.1 样品采集 采集4.1.4描述的典型 症状的卵、小蚕、大蚕、蛹、蛾 ，样品置于样品袋或离心管中，做好记载。 4.1.6.2 样品处置 DB51/T 1185 —2025 3 每份样品先混合均匀， 再分成2份，其中 1份作为检样 ，另1份作为备样保存于 4 ℃冰箱中备用， 保存期30 d～60 d。 不同发育阶段的样品，按照下列方法处置： a) 卵期样品解除滞育后，在生化培养箱温度（ 29±0.5）℃、相对湿度 大于等于 85％的条件下催 青；孵化后待其自然死亡 ； b) 小蚕期蚁蚕样品 在生化培养箱温度 （ 29±0.5）℃、 相对湿度 大于等于 85 %的条件下， 放置 2 d～ 3 d； c) 小蚕期其他阶段、大蚕期、蛹期、蛾期样品不需处置。 4.1.6.3 样本制备 将上述处置后的样本分别置于研钵中，每个研钵各放 1个研磨棒，磨碎；滴入氢氧化钾溶液 [w(KOH)=2％]，研细备用。 4.1.6.4 显微镜观察 4.1.6.4.1 直接观察法 按照序号， 将磨碎液用研磨棒点样至载玻片， 盖上盖玻片， 制成镜检样本， 用普通光学显微镜观察。 4.1.6.4.2 离心沉淀法 将4.1.6.3制备的磨碎液， 加入适量无菌水 ，用无纺布滤纸过滤后，将滤液移入离心管中，经 3000 r/min离心3 min，倾去上清 液，沉淀物振荡制 成镜检样本 ，用普通光学显微镜观察 。 4.1.6.4.3 酸溶解法 将检出有微粒子 孢子的磨碎液吸取 2滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中 1点加1滴浓盐 酸[w(HCl)=30 ％]，另1点作对照，在 30℃生化培养箱中放置 10 min～20 min后