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ICS 11.220 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 4195—2025 牛结节性皮肤病样品采集技术规范 Technical Specifications for Sample Collection of Lumpy Skin Disease 2025-09-30发布 2025-10-30实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 4195 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会( SAM/TC 19 )归口。 本文件起草单位:内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、金宇保灵生物药品有限公司、呼伦贝尔市 动物疫病预防控制中心、阿拉善盟动物疫病预防控制中心、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、巴彦淖 尔市动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人:郭宇、王旭红、王建龙、萨茹拉、张璇、刘然、特木尔巴根、狄栋栋、苏胜杰、 武琥琮、王巍、郭少平、杨波、刘海成、郭文。 DB15/T 4195 —2025 1 牛结节性皮肤病采样技术 规范 1 范围 本文件规定了牛结节性皮肤病样品采集、保存、运输及废弃物处置等技术规范和要求。 本文件适用于牛结节性皮肤病的检测、诊断、监测、免疫效果评价等兽医实验室样品采集工作。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 样品 specimen 取自牛或环境,拟通过检验反映牛个体、群体或环境有关状况的材料或物品。 采样 sampling 按照规定的程序和要求从牛或周围环境取得一定量样本,并经过处理作为检测用样品的过程。 灭菌 sterilization 采用物理或化学方法杀灭或清除所有微生物的方法。 废弃物 hazardous waste 有潜在生物危险、可燃、易 燃、腐蚀、有毒和有感染风险的对人、环境有害的一切废弃物。 4 采样前准备 采样器材 DB15/T 4195 —2025 2 4.1.1 器械:解剖刀、手术剪刀、镊子、采血器、针头。 4.1.2 容器:真空采血管(含 EDTA或肝素钠抗凝剂)、离心管( 1.5 mL、2 mL)、样品保存管、样品 保存盒(袋)。 4.1.3 其他:医用棉签、 75%酒精棉球、碘酊棉球、封口膜、冰袋、试管架、样品运输箱。 防护用品 一次性口罩、防护服、手套、鞋套、护目镜、面罩。 记录用品 中性笔、记号笔、防水标签纸、采样表等。 样品保存液 4.4.1 0.1 mol/L PBS(pH7.4) 缓冲液,配制方法见附录 A中的A.1。 4.4.2 10%甘油-PBS缓冲液,配制方法见附录 A中的A.2。 5 样品的采集与处理 基本原则 5.1.1 病毒分离和核酸检测时,优先采集皮肤结节(痂皮)、淋巴结、肺、脾等组织上的病变结节及 周围组织和口鼻拭子等样品, 在牛急性感染期可采集抗凝血进行检测; 抗体检测时, 优先采集血清样品。 5.1.2 样品采集、前处理、制备时要做好个人生物安全防护,避免交叉污染,具体按照 GB 19489 的规 定执行。 5.1.3 解剖刀、手术剪刀、镊子使用前应经 121 ℃高压蒸汽或煮沸 30 min灭菌处理,临用时可用 75% 酒精擦拭或经火焰灭菌处理。 5.1.4 采样后的废弃物等按照《医疗废物管理条例》进行无害化处理。 血样 5.2.1 血样的采集 5.2.1.1 采血前准备 采血前应对采血部位的皮肤剃毛,用 1%~2%碘酊消毒后,再用 75%的酒精棉球由内向外螺旋式脱碘 消毒,干燥后采血。采血时可用采血器或真空采血管。 5.2.1.2 尾静脉采血 将牛尾提起,在离尾根大约 10 cm中间凹陷处,垂直刺入采血器针头约 1 cm,见有回流血液时,随 即向外拉针芯使血液流入采血器或接入真空采血管,采血后立即用棉球按压止血,止血后用碘伏棉球对 采血部位消毒。 5.2.1.3 颈静脉采血 在采血部位 下方用手压迫颈静脉血管,使其怒张后使针头与皮肤呈 45°角由下向上方刺入血管, 见 血液回流时,随即向外拉针芯使血液流入采血器或接入真空采血管,采血后立即用棉球按压止血,止血 后用75%的酒精棉球对采血部位消毒。 DB15/T 4195 —2025 3 5.2.2 血样的处理 5.2.2.1 全血样品 采集不少于 3 mL的血液样品到含 EDTA或肝素钠抗凝剂的真空采血管中,采血后要轻轻上下颠倒,使 抗凝剂与血液充分混合。 5.2.2.2 血清样品 采集不少于 5 mL的血液样品,将装有血液的采血器在室温下静置 2 h~4 h,待血液凝固析出血清后 置于4 ℃冰箱过夜,用移液器无菌吸出血清至 1.5 mL离心管内;急用时可采用低速离心机 (1000 g离心 10 min~15 min)分离血清。 皮肤结节和痂皮 5.3.1 先用0.1 mol/L PBS(pH 7.4) 缓冲液清洗皮肤表面,再用无菌手术剪刀取 2 g~5 g结节,放入 样品保存管内,加入 10%甘油-PBS保存液,并没过样品,加盖密封, -20 ℃冷冻保存。 5.3.2 用手术剪刀取 2 g~5 g痂皮和周围组织病料,放入样品保存管内,加入 10%甘油-PBS保存液并 淹没全部样品,加盖密封, -20 ℃冷冻保存。 口腔/鼻腔拭子 取无菌医 用棉签插于牛口腔和鼻腔,轻轻擦拭并慢慢旋转 2~3圈沾取鼻腔分泌物,拭子取出后立即 放入2 mL离心管中,加入 0.1 mol/L PBS(pH7.4) 缓冲液或 10%甘油-PBS保存液,加盖密封, -20 ℃冷冻 保存。 组织样品 5.5.1 病死牛在剖检时,可采集淋巴结、肺、脾等组织的病变结节及周围组织 2 g~5 g,放入样品保 存管内,加入 10%甘油-PBS保存液,并没过样品,加盖密封, -20 ℃冷冻保存。 5.5.2 临床健康牛,可在屠宰时采集淋巴结、疑似结节组织样品 2 g~5 g,放入样品保存管内,加入 10%甘油-PBS保存液,并没过 样品,加盖密封, -20 ℃冷冻保存。 环境样品 5.6.1 可采集牛圈中的垫料、粪便或尿液 2 g~5 g, 放入样品保存管内, 加盖密封, -20 ℃冷冻保存。 5.6.2 可采集饲料槽、饮水槽的拭子样品,放入 2 mL离心管中,加入 0.1 mol/L PBS(pH7.4) 缓冲液 或10%甘油-PBS保存液,密封后 -20 ℃冷冻保存。 媒介样品 5.7.1 在牛耳部、颈部、腋窝、腹股沟、尾巴等部位采集牛身上的蚊、蝇、蜱等媒介样品,尽量保证 样品的完整性,放入装有 70%乙醇的样本保存管内,加盖密封, -20 ℃冷冻保存。 5.7.2 在牛舍、挤奶厅、饮水处、活动场地周围 悬挂捕蝇笼或放置粘蝇纸(带、板),放置 24 h~48 h后,将捕蝇笼或粘蝇纸(带、板)上的蚊、蝇等媒介样品取下放入样本保存管中, -20 ℃冷冻保存。 6 样品的标记与包装 在装有样品的离心管盖和管壁上用记号笔标记样品的编号,标记的样品编号按照采样顺序编写, 并与采样单填写的编号一致。 DB15/T 4195 —2025 4 皮肤结节、痂皮、组织、环境、媒介等样品应置于特定的样品盒(袋)内,注明采样场点、采样 时间、样品名称、数量、编号等。 口鼻拭子、血清等样品装于离心管中,应置于特定的样品盒(袋)内,注明采样场点、采样时间、 样品名称、数量、编号等。 抗凝血样品应置于试管架上后装入自封袋中, 防止运输过程中撞裂污染其他样品, 注明采样场点、 采样时间、样品名称、数量、编号等。 外包装上标注放置的方向,并贴封条,封条上应有采样人签章、贴封日期。 7 样品的保存与运输 样品的保存 7.1.1 样品采集后无法在 12 h内送达兽医实验室的,应根据不同的检测要求,分类保存在冰箱或低温 冰柜中。 7.1.2 供病毒分离的样品应在 0 ℃以下低温保存,做核酸检测的样品可 -20 ℃及以下冷冻保存。 7.1.3 送达实验室,血清、口鼻拭子样品应在 -20 ℃以下冷冻保存;全血在 4 ℃低温保存;皮肤结节 和痂皮、组织、淋巴结等样品应 -80 ℃冷冻保存。 样品的运输 7.2.1 样品采集后,应以最快最直接的途径送至实验室。 7.2.2 对于采集后能在 24 h内送达实验室的样品,可放在 4 ℃的容器中冷藏运输;对于超过 24 h内 送达实验室的样品,在不影响监测结果的前提下在冷冻状态运送。 7.2.3 样品运输箱应完整无损,密封防止漏液,必要时经清洁、灭菌后使用。运输箱内需加填防震材 料避免样品晃动。样品运输应符合生物安全要求。 8 采样记录 应清晰标识每份样品的编号,同时在采样单上填写采样相关信息。 应记录养殖场(户)的地址和经纬度,及 养殖场(户)姓名、电话
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