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ICS 65.020.01 CCS B 16 46 海 南 省 地 方 标 准 DB 46/T 711—2025 胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范 Technical specification for pathogen molecular detection of black pepper Phytophtora foot rot 2025 - 08 - 11发布 2025 - 10 - 31 实施 海南省市场监督管理局 发 布 DB 46/T 711—2025 I 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 原理 ............................................................................... 1 5 器材与试剂 ......................................................................... 1 主要器材 ....................................................................... 1 主要试剂 ....................................................................... 2 6 检测方法 ........................................................................... 2 样品采集 ....................................................................... 2 DNA提取 ........................................................................ 2 PCR反应 ........................................................................ 2 PCR产物检测 .................................................................... 3 7 结果判定 ........................................................................... 3 8 结果记录与档案保存 ................................................................. 3 9 样品处置 ........................................................................... 3 附录 A(资料性) 胡椒瘟病病原菌分子检测报告表 ......................................... 4 附录 B(资料性) PCR产物电泳图谱 ..................................................... 5 参考文献 .............................................................................. 6 图 B.1 PCR 产物电泳图谱 ............................................................... 5 表 1 PCR反应体系 ..................................................................... 3 表 A.1 胡椒瘟病病原菌分子检测报告表 ................................................... 4 DB 46/T 711—2025 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由海南省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位:中国热带农业科学院香料饮料研究所。 本文件主要起草人:高圣风、王亚男、苟亚峰、孙世伟、刘世超、杨建峰、田甜、温思为。 DB 46/T 711—2025 1 胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范 1 范围 本文件确立了胡椒瘟病病原菌( Phytophtora capsici )PCR检测的原理,规定了器材和试剂、检测 方法、结果判定、结果记录与档案保存、样品处置的要求和方法。 本文件适用于胡椒种苗及大田植株上的胡椒瘟病病原菌的PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 3816 热带作物病虫害监测技术规程 胡椒瘟病 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 胡椒瘟病 black pepper Phytophthora foot rot 由辣椒疫霉菌( Phytophthora capsici )引起的胡椒卵菌病害,又称胡椒基腐病。 [来源:NY∕T 3816—2020,2.1,有修改] 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction,PCR 先高温变性,使模板DNA成为单链;接着降温退火,使单链与引物通过碱基互补进行结合;再中温 延伸,在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使新链沿引物方向合成延伸;然后循环 扩增,通过多次重复变性、退火和延伸过程使靶标片段以几何倍数扩增。 [来源:NY∕T 2252—2012,2.3,有修改] 4 原理 三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因( Ypt1)在疫霉属( Phytophthora )的物种间存在丰富的变异,而在 物种内却高度保守,可以为疫霉菌的PCR检测提供理想的靶序列。根据胡椒瘟病病原菌 Ypt1设计特异性 引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期230 bp的DNA片段,判断样品中是否携带胡椒瘟病病原菌。 5 器材与试剂 主要器材 DB 46/T 711—2025 2 组织研磨器、台式离心机、冰箱、PCR 检测仪、电泳仪、凝胶成像仪、冰箱、剪刀、镊子、样品 密封容器、1.5 mL离心管、研磨杵、可调量程移液器(0.1 μL~2.5 μL,0.5 μL~10 μL,10 μL~ 100 μL,100 μL~1 000 μL)、吸头、0.2 mL PCR管等,其中接触样品的器材应是洁净无菌的。 主要试剂 5.2.1 通用要求/试剂纯度等级 除另有规定外,所有试剂的纯度均为分析纯或生化试剂。实验室用水应符合 GB/T 6682 要求。 5.2.2 DNA 提取试剂 推荐使用一步法DNA提取缓冲液,配制方法为:在900 mL ddH 2O水中加入1.46 g 氯化钠、2.42 g 三 羟甲基氨基甲烷(Tris)、20 g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)、0.73 g 乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5 g 十 二烷基硫酸钠(SDS),用1 mol/L盐酸调整pH至8.0,定容至1 000 mL。室温保存。 可选择植物或真菌DNA提取试剂或试剂盒。 5.2.3 PCR 反应试剂 见表1,或采用同类型的PCR 扩增试剂或试剂盒。其中PCR 引物的序列如下: 上游引物:5’-GACGTTTTAGTTAGAGCAC-3’; 下游引物:5’-AATGGCACTGAAGTTCTG-3’。 5.2.4 凝胶检测试剂 琼脂糖、Tris-乙酸(TAE)缓冲液(40 mmol/L Tris-乙酸,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)、上样缓冲 液(loading buffer)、DNA 分子量Marker、GoldView 或同类核酸染料。 6 检测方法 样品采集 按照NY∕T 3816 的相关规定进行田间诊断,对于带有疑似胡椒
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