ICS 65.020.20 CCS B 39 3301 浙江省杭州市 地方标准 DB3301/T 1134—2023 秀珍菇菌种繁育技术规程 2023-12-31发布 2024-01-31实施 杭州市市场监督管理局 发布 DB3301/T 1134 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 杭州市农业农村局 提出、归口并组织实施。 本文件起草单位：杭州市农业科学研究院、杭州市农业技术推广中心（杭州市植保植检中心）、桐 庐县农业技术推广中心、淳安县农业农村发展服务中心、杭州临安鼎新农业科技有限公司。 本文件主要起草人：陆娜、王伟科、闫静、俞斌、宋吉玲、林佳瑶、周祖法、袁卫东、郎强军、周 小华、何爱珍。 DB3301/T 1134 —2023 1 秀珍菇菌种繁育技术规程 1 范围 本文件规定了秀珍菇菌种的生产条件、种源、生产技术、贮存运输、生产档案等要求。 本文件适用于秀珍菇固体菌种和液体菌种繁育。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 12728 食用菌术语 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1731 食用菌菌种良好作业规范 DB33/T 929 食用菌菌种场建设规范 3 术语和定义 GB/T 12728 和NY/T 528 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 摇瓶种 liquid spawn in shake flask 将斜面菌种接种于装在三角摇瓶内的液体培养基中，并采用摇床恒温振荡或磁力搅拌培养形成的 液体形态的菌丝体纯培养物。 发酵罐种 liquid spawn in fermenter 在发酵罐中采用液体培养基， 通过深层培养 （液体发酵） 技术而形成的液体形态的菌丝体纯培养物。 4 生产条件 场地选址应符合 DB33/T 929 的规定。 环境要求应符合 NY/T 1731 的规定。 设施设备应符合 DB33/T 929 的规定。液体菌种应设独立培养间、空气净化系统、温控设施，配备 液体菌种培养器、液体菌种接种器、显微镜、摇床、磁力搅拌器和酸度计等仪器设备。 5 种源 宜选择经国家、省认定的品种，或选用种性明确、并经过两个以上生产周期试验、适合于设施栽培 和工厂化栽培的品种。 6 生产技术 DB3301/T 1134 —2023 2 固体菌种 6.1.1 工艺流程 固体菌种生产工艺流程图如图 1所示。 图1 固体菌种生产工艺流程 6.1.2 母种 6.1.2.1 容器：18 mm×180 mm或20 mm×200 mm玻璃试管。 6.1.2.2 培养基配方：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ PDA）。 6.1.2.3 分装： 分装量宜为试管长度的五分之一至四分之一， 培养基斜面顶端距试管口不少于 50 mm。 6.1.2.4 灭菌：0.11 MPa ～0.12 MPa ，温度121℃，30 min。 6.1.2.5 斜面制作：当试管冷却到 60℃左右时，趁热将试管倾斜摆放在操作台面上，试管口比试管底 部高1 cm～2 cm，斜面长度为试管长度的 2/3。 6.1.2.6 冷却：将试管继续放置操作台中 冷却，温度降至25℃以下。 6.1.2.7 接种：在接种室或超净工作台上严格按无菌操作规程接种，一支原始菌株转接 20支斜面试 管。 6.1.2.8 培养：将接种后的试管置于 24℃～26℃培养箱或者培养室恒温培养 7 d～9 d，当菌丝长满试 管斜面，即可用于生产原种。 6.1.3 原种 6.1.3.1 容器：850 mL聚丙烯塑料瓶或 15 cm×28 cm×0.05 cm 聚丙烯塑料袋， 750 mL广口玻璃瓶。 6.1.3.2 培养基配方：棉籽壳 60%、木屑20%、麸皮18%、石灰1%、石膏1%，培养基含水量 58%～60%。 6.1.3.3 分装：培养基装至距瓶（袋）口不少于 60 mm,灭菌后不少于 45 mm。 6.1.3.4 灭菌：立即灭菌， 0.14 MPa ，126℃，2 h～3 h。 DB3301/T 1134 —2023 3 6.1.3.5 冷却：将灭菌后的原种放置在冷却室中冷却，料温降至 25℃以下。 6.1.3.6 接种：在接种室或超净工作台上严格按无菌操作规程接种，一支母种移植原种 3袋（瓶）～ 5袋（瓶），接种后贴好标签。 6.1.3.7 培养：培养室应预先清洗消毒。培养时间 35 d～40 d，培养温度以 25℃～27℃为宜，空气相 对湿度维持 65%～70%左右，定期通风，避光培养，并定期检查，挑除感染杂菌的菌袋（瓶）。 6.1.3.8 留样：原种 应留样备查 ，数量 5瓶（袋） ～7瓶（袋） ，于4℃～6℃下贮存。留样时间 至使 用者在正常生产条件下该批菌种出第一潮菇。 6.1.4 栽培种 6.1.4.1 容器：15 cm×30 cm×0.05 cm 聚丙烯塑料袋。 6.1.4.2 培养基配方：棉籽壳 30%、木屑50%、麸皮18%、石灰1%、石膏1%，含水量 58%～60%。 6.1.4.3 分装：按 6.1.3.3 规定执行，袋套环套盖规格应与袋子相配套。 6.1.4.4 灭菌：立即灭菌 ，0.14 MPa ，126℃，2 h～3 h。 6.1.4.5 冷却：按 6.1.3.5 规定执行 。 6.1.4.6 接种： 在接种室或超净工作台上严格按无菌操作规程接种， 一袋 （瓶） 原种移植栽培种 45袋～ 50袋，接种后贴好标签。 6.1.4.7 培养：按 6.1.3.7 规定执行。 6.1.4.8 留样：按 6.1.3.8 规定执行。 液体菌种 6.2.1 工艺流程 液体菌种生产工艺流程如图 2所示。 图2 液体菌种生产工艺流程 DB3301/T 1134 —2023 4 6.2.2 母种 按6.1.2规定执行。 6.2.3 摇瓶种 6.2.3.1 容器：以 1000 mL 的常规三角瓶为宜。 6.2.3.2 培养基配方：选择马铃薯葡萄糖综合培养基（新鲜马铃薯去皮 200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨 3 g、磷酸二氢钾 0.5 g、硫酸镁 1 g、水1000 mL）。 6.2.3.3 分装量：规格的 60%。 6.2.3.4 灭菌：0.11 MPa ～0.12 MPa 、温度121℃下灭菌 30 min。 6.2.3.5 冷却：在冷却室中冷却至 25℃。 6.2.3.6 接种：在超净工作台上严格按无菌操作规程接种，接种量为 0.5 cm2的琼脂斜面母种块 5块～ 8块。 6.2.3.7 培养：在 25℃、150 r/min 转速下培养 7 d～8 d。 6.2.4 发酵罐种 6.2.4.1 容器：根据生产规模选择相应发酵罐的容积，以 1000 L的规格为宜。 6.2.4.2 培养基配方：玉米粉培养基（玉米粉 2000 g、蔗糖6000 g、葡萄糖 1000 g、磷酸二氢钾 500 g、硫酸镁 250 g、消泡剂 400 mL、水1000 L，pH值自然）；豆粕培养基（豆粕 3200 g、蔗糖12000 g、酵母膏 2000 g、磷酸二氢钾 1000 g、硫酸镁 500 g、消泡剂 400 mL、水1000 L，pH值自然）。 6.2.4.3 罐体灭菌：应先空罐灭菌（蒸汽压力 0.14 MPa ，温度126℃，40 min）。 6.2.4.4 分装：注入罐容积的 70%～80%的清水，通气使罐内液体翻腾，然后加入培养基各组分，然后 擦拭干净罐内外沉积的物料，最后盖好罐盖，拧紧盖口。 6.2.4.5 灭菌：发酵罐培养基在 0.11 MPa ～0.12 MPa 、温度121℃下灭菌 40 min。 6.2.4.6 冷却：通过冷却系统，使培养基降温至 25℃，保持微压。 6.2.4.7 接种：发酵罐 接种时用75%酒精对接种口及周边进行擦拭 消毒，将火焰圈缠绕接种口， 当发 酵罐罐内压力调整至 0.01 MPa 时，打开接种口， 点燃火焰圈，迅速注入 摇瓶种，接种量为 0.1%，完成 后迅速关闭接种口阀门，熄灭火焰圈，保持通气口畅通。 6.2.4.8 培养：根据菌丝生长情况对通风量进行调节，通气量为 1:0.8～1:1（料液体积 /空气体积）， 同时调节排气阀，维持罐压在 0.02 MPa ～0.05 MPa ，培养温度在 25℃，培养时间 5 d～7 d(因品种而 定)，提前1 d～2 d检查菌丝体感官指标和理化指标符合表 1、表2的规定。 表1 发酵罐液体菌种感官指标 项目 指标 色泽 球状菌丝体呈白色，菌液澄清不浑浊 形态 菌丝体颗粒均匀、不分层，菌液稍粘稠 气味 淡香气，无异味 表2 发酵罐液体菌种理化指标 项目 检测方法 指标 pH pH检测计 5.5～6.5 显微形态