ICS65.020.01 CCSB60 21 辽宁省地方标准 DB21/T3692—2023 蓝莓常见品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 Technicalspecificationforidentificationofcommonblueberryvarieties bySSRmolecularmarkers 2023-01-30发布 2023-03-02实施 辽宁省市场监督管理局  发布DB21/T3692—2023 I目次 前言..................................................................................II 1范围................................................................................1 2规范性引用文件......................................................................1 3术语和定义..........................................................................1 4试验准备............................................................................2 5操作程序............................................................................2 6结果分析............................................................................4 附录A（规范性）仪器设备与化学试剂....................................................5 附录B（规范性）溶液配制..............................................................6 附录C（规范性）核心引物信息..........................................................8 附录D（资料性）扩增图谱..............................................................9 附录E（资料性）指纹图谱.............................................................10 附录F（规范性）指纹图谱鉴定报告.....................................................11 图D.1引物SSR1007、SSR1183、SSR160在12个蓝莓主栽品种中的扩增图谱....................9 表C.14对SSR核心引物信息............................................................8 表E.112个蓝莓主栽品种的SSR数字指纹图谱............................................10 表F.1蓝莓品种SSR指纹图谱鉴定报告...................................................11DB21/T3692—2023 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由辽宁省林业和草原局提出并归口。 本文件起草单位：大连大学、大连森茂现代农业有限公司。 本文件主要起草人：徐国辉，王贺新，楚立威，娄鑫，赵倩，温立柱，崔青青，周永斌。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话： 024-23448927。 文件起草单位通讯地址：大连大学（大连市经济技术开发区学府大街10号），联系电话： 0411-87402346。DB21/T3692—2023 1蓝莓常见品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 1范围 本文件规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记法对12个常见蓝莓品种， 进行鉴定过程中样品准备、DNA提取、DNA质量检测、PCR扩增、PCR产物检测等方面的技术要求。 本文件适用于SSR分子标记技术构建12个常见蓝莓品种DNA指纹图谱过程中DNA分子数据采集和 鉴别。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 LY/T2426枣品种鉴定技术规程SSR分子标记法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 聚合酶链式反应PCRpolymerasechainreaction 聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR)，是以DNA为模板，在DNA聚合酶、引物、dNTP 的共同作用下使目标片段扩增并用于检测分析。 3.2 SSR标记simplesequencerpeatsmarker 由几个核苷酸（一般为1~6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。 3.3 核心引物coreprimers 扩增产物具有高度的稳定性和一致性，并具有较强的鉴别能力，可以用于进行12个蓝莓常见品种比 对的人工合成引物。 3.4 SSR指纹图谱SSRfingerprintDB21/T3692—2023 2利用SSR核心引物，对不同的蓝莓品种进行PCR扩增，根据不同品种在DNA水平上的差异，利用聚 丙烯酰胺凝胶电泳技术，获得的具有差异片段的成像图，并通过引物结合字母标记法对不同的蓝莓品种 进行特异性标记。 4试验准备 4.1仪器与试剂 仪器与试剂详见附录A。 4.2溶液配制 溶液配制方法详见附录B，其中试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求，其中银染、 显色溶液的配制可以使用符合三级水的要求。 4.3核心引物 核心引物信息详见附录C。 5操作程序 5.1样品准备 选取蓝莓新鲜叶片，-20℃运输，-80℃进行长期保存。 5.2DNA提取 对于采集的新鲜嫩叶，使用试剂盒（TIANGEN）进行DNA提取。操作步骤如下： a)处理材料：取植物新鲜叶片20mg，加入液氮充分碾磨后转移至1.5mL离心管中，加入400µL 缓冲液（LP2）和6µLRNaseA(10mg/mL)，漩涡震荡1min，室温放置10min； b)加入130µL缓冲液（LP2），充分混匀，漩涡震荡1min； c)12,000rpm(~13,400×g)离心5min，将上清液移至新的离心管中； d)加入1.5倍体积的缓冲液（LP3）（例如500µL的上清液加750µL缓冲液（LP3）），立即充 分振荡混匀15s。此时会出现絮状沉淀； e)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱（CB3）中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)离心30s，倒掉废液，吸附柱（CB3）放入收集管中； f)向吸附柱（CB3）中加入600µL漂洗液（PW）（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)离心30s，倒掉废液，吸附柱（CB3）放入收集管中； g)重复操作步骤f； h)将吸附柱（CB3）放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱（CB3） 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； i)将吸附柱(CB3)转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50µL-200µL洗脱缓 冲液（TE），室温放置2min-5min，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心 管中，以待检测。 5.3DNA质量检测 5.3.1琼脂糖凝胶电泳检测DNADB21/T3692—2023 3取1µL提取的DNA原液，在100V的电压下，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳20min左右，取出凝胶， 在紫外凝胶成像系统上观察电泳条带应单一、无拖尾。 5.3.2鉴定DNA的浓度和质量 吸取1.5µL提取的DNA原液，通过NanoDrop检测DNA浓度和是否有RNA、蛋白质或酚污染，纯净 样品DNAOD260/OD280的比值应在1.7-1.9之间。 5.4PCR扩增 5.4.1反应体系 SSR的反应体系：正反向引物（10µmol/L）各1µL、2×TaqPCRMasterMix8µL、模板100ng、 添加灭菌超纯水至20µL。所使用的SSR引物根据已公布的蓝莓品种Drapper基因组自主研发获得。 5.4.2反应程序 94℃预变性10min，94℃变性40s，退火70s（具体退火温度根据引物来定，详见附录C），72℃ 延伸2min，35个循环，72℃延伸10min。 5.5PCR产物检测 扩增产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，通过扫描仪进