ICS 65.120 B 46 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2050—2014 动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光 PCR 方法 Determination of porcine derived materials in animal-originated feedstuffs Real-time PCR method 2014 - 02 - 28 发布 2014 - 04 - 30 实施 吉 林省质 量 技 术监 督 局 发 布 DB22/T 2050—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华 人民共和国吉林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、华蕾、王潇、亓晓艳、王颖、冷喜芳、吴桐、陈颖。 I DB22/T 2050—2014 动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光 PCR 方法 1 范围 本标准规定了动物源性饲料中猪源性成分的实时荧光PCR检验方法，该方法的检出限为0.1%。 本标准适用于动物源性饲料中猪源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪源性成分 porcine -derived materials 猪种属特异性 DNA 片段。 3.2 实时荧光PCR real time PCR 实时荧光聚合酶链式反应。 3.3 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 对样品进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，检测饲料中猪源性 成分。 5 试剂 除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。 1 DB22/T 2050—2014 5.1 引物和探针 a) 上游引物：5’- CATGCGTATCACCACCATTATATC-3’ b) 下游引物：5’- TGCCAAGCGGGTTGCT-3’ c) 探针：FAM- CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA –TAMRA 5.2 Taq DNA 聚合酶。 5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidine triphosphate， 脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。 5.4 动物基因组 DNA 提取纯化试剂盒。 5.5 RNase A 酶：冻干品，不含 DNase。 5.6 蛋白酶 K：冻干品。 5.7 75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷、异戊醇、正己烷等有机试剂。 5.8 Tris 饱和苯酚。 5.9 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 5.10 三水合乙酸钠、氯化钠。 5.11 十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide，CTAB）。 5.12 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2·2H2O）。 5.13 10×PCR 缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾（KCl），15 mmol/L 氯 化镁（MgCl2 ）。 5.14 RNase A 酶溶液：用高压灭菌的去离子水溶解 RNase A 酶为 10 g/L 的溶液，分装后于-20 ℃保存， 避免反复冻融。 5.15 蛋白酶 K 溶液：用高压灭菌的去离子水溶解蛋白酶 K 为 20 mg/mL 的溶液，分装后于-20 ℃保存， 避免反复冻融。 5.16 乙酸钠溶液，3 mol/L：在 80 mL 水中，加入 40.81 g 三水合乙酸钠，溶解后用冰乙酸调节 pH 值 到 5.2，用水定容到 100 mL，分装后高压灭菌。 5.17 Tris-HCl，1 mol/L，pH8.0：在 800 mL 去离子水中溶解 121.1 g Tris，冷却至室温后用浓盐酸调节 溶液的 pH 值至 8.0，加水定容至 1 L，分装后高压灭菌。 5.18 EDTA，0.5 mol/L，pH8.0：称取 186.1 g EDTA-Na2·2H2O，加入 700 mL 水中，在磁力搅拌器上 剧烈搅拌，用 10 mol/L 氢氧化钠调 pH 值至 8.0，用水定容到 1 L，分装后高压灭菌。 5.19 CTAB 提取缓冲液 I：在 800 mL 去离子水中加入 46.75 g 氯化钠，溶解后加入 1 mol/L Tris-HCl （pH8.0）50 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 10 mol/L 氢氧化钠 调节溶液的 pH 值至 8.0，用水定容至 1 L，分装后高压灭菌。 5.20 CTAB 提取缓冲液 II：在 800 mL 去离子水中加入 46.75 g 氯化钠，20 g CTAB，完全溶解后加入 1 mol/L Tris-HCl （pH8.0）50mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，用水定容至 1 L，分装后高压灭菌。 5.21 Tris 饱和苯酚和三氯甲烷混合液，V (Tris 饱和苯酚)+V (三氯甲烷)=1+1。 5.22 三氯甲烷和异戊醇混合液，V (三氯甲烷)+V (异戊醇)=24+1。 5.23 TE 缓冲液（pH8.0）：在 800 mL 水中，依次加入 10 mL 的 1 mol/L Tris-HCl （pH8.0）和 2 mL 的 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用水定容到 1 L，分装后高压灭菌。 6 仪器和设备 2 DB22/T 2050—2014 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 实时荧光 PCR 仪。 生物安全柜。 离心机：转速≥12000 r/min。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 高压灭菌器。 恒温水浴锅。 移液器：0.5 μL～10 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200 μL、200 μL～1 000 μL。 pH 计。 6.9 振荡器。 7 检测步骤 7.1 试样的预处理 50 g固体样品粉碎，颗粒大小在0.125 mm以下。 7.2 DNA 提取和纯化 7.2.1 CTAB 法制备非油脂类饲料模板 DNA 称取100 mg粉碎后的样品于1.5 mL离心管中，加入300 μL冰上预冷的CTAB提取缓冲液I，加入500 μL于65 ℃预热的CTAB提取缓冲液II，混匀，65 ℃保温30 min～90 min，期间不时轻缓颠倒混匀；加入 5 μL～25 μL蛋白酶K溶液，上下倒转混匀，37 ℃水浴中保温1 h，中途每隔10 min左右倒转混合数次； 待冷却至室温后加入5 μL RNase A 溶液（10 mg/mL)，室温下放置30 min；室温12 000r/min 离心10 min， 取上清液，于另一干净的2 mL离心管中，分别用等体积Tris饱和苯酚、Tris饱和苯酚+三氯甲烷（1+1） 和三氯甲烷+异戊醇（24+1）抽提三次，12 000r/min 离心10 min；将上清液转移至干净的2 mL离心管中， 加入等体积异丙醇及1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀；12 000r/min 离心10 min，弃上清 液，用500 μL 75%乙醇洗涤沉淀两次；除去残留的乙醇，干燥后，DNA沉淀溶解于100 μL TE缓冲液（预 先加热至65 ℃有利于溶解DNA）中，-20 ℃保存备用。 7.2.2 CTAB 法制备油脂类饲料模板 DNA 取油脂饲料适量（液态油取30 mL、磷脂类和固态油脂取5 g）放入250 mL三角瓶中，加入25 mL正 己烷，于磁力搅拌器上不断振荡混合2 h后，加入25 mLCTAB提取缓冲液II，继续于磁力搅拌器上振荡 混合2 h；将溶液转入100 mL离心管中，于8 000 r/min离心10 min，使有机相和水相分离，取下层水相， 加入与下层水相溶液等体积的异丙醇及水相溶液1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀，室温放 置10 min；12000 r/min 离心10min，弃上清液，待沉淀干燥后用200 μL TE缓冲液溶解沉淀，加入200 μL Tris饱和苯酚+三氯甲烷（1+1），轻缓颠倒混匀溶液；12000 r/min 离心10 min，取上清液，加入与上清 液等体积三氯甲烷+异戊醇（24+1），轻缓颠倒混匀，12000 r/min 离心2 min至分层；将上清液转移至 干净的离心管中，加入与溶液等体积的异丙醇及溶液1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀；室 温放置10 min后，12000 r/min 离心10 min，弃上清液后，依次加入800 μL体积分数为75%的乙醇和100 μL 体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀；12000 r/min 离心5 min，除乙醇溶液；待沉淀干燥后，DNA沉淀溶解 于100 μL TE缓冲液（预先加热至65 ℃有利于溶解DNA）中，-20 ℃保存备用。 7.2.3 试剂盒法 采用商品化的动物源性基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。 3 DB22/T 2050—2014 注：DNA提取和纯化过程应用水作为核酸提取空白对照。 7.3 DNA 浓度和纯度的测定 取10 μL DNA溶液加蒸馏水稀释至1 mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩 增前将所有样品DNA调至10 ng/μL～50 ng/μL。 c= A ´ N ´ 50 .............................................................................................(1) 1000 式中： c——