ICS 65.020 B 16 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2140—2014 大豆抗菌核病鉴定技术规程 Rule for evaluation in soybean resistance to sclerotinia stem rot 2014 - 11 - 25 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 12 - 25 实施 发 布 DB22/T 2140—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院。 本标准主要起草人:王义生、张伟、徐文静、李启云、张金花、杨向东。 I DB22/T 2140—2014 大豆抗菌核病鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了室内离体叶柄接种法对大豆菌核病抗性鉴定的试验条件、病原物接种体的制备、试验 设计、鉴定方法、调查及抗性评价等技术方法和评价标准。 本标准适用于栽培大豆对菌核病的抗性鉴定。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 大豆菌核病 sclerotinia stem rot of soybean 由核盘菌 [Sclerotinia sclerotiorum（Lib．）de Bary] 侵染大豆引起的真菌性病害。 2.2 PDA 培养基 potato dextrose agar medium 按一定比例人工配置的马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基，可以使病原体在其上生长的基质，简称PDA 培养基。 2.3 抗性评价 evaluation of resistance 根据采用的技术标准判别植物寄主对特定病虫害反应程度和抵抗水平的描述。 2.4 致病性 pathogenicity 病原物侵染寄主植物引起发病的能力。 3 试验条件 3.1 试验材料 大豆 3.2 仪器设备 a) 电子天平（感量 0.1 mg） b) 人工气候箱或可控温湿度培养箱（5 ℃～60 ℃，精度为 0.1 ℃） c) 游标卡尺（精度 0.1 mm） 1 DB22/T 2140—2014 d) 灭菌的不锈钢方盘（30 cm × 40 cm × 3 cm） 4 病原物接种体制备 4.1 病原菌来源 大豆核盘菌由吉林省农业科学院植物保护研究所大豆病害研究室提供（经专家鉴定），具体形态症 状见附录A。 4.2 病原菌的繁殖 选用PDA培养基扩大繁殖。将核盘菌菌丝于PDA平板上培养，25 ℃条件下培养4 d，待菌丝长满平皿 后备用。 4.3 病原菌的保存 收集PDA培养基上的菌核于灭菌的试管中封严，置于4 ℃冰箱保存。 5 试验设计 5.1 选择前茬不是大豆的田地作为鉴定圃，将参鉴品种随机排列，每个品种种植行长 5 m，1 行区， 10 cm 等距点播。每 15 份～20 份材料设已知抗、感病性稳定的对照品种 1 组。 5.2 抗性鉴定采用的对照材料为：吉育 35（高抗）；吉农 21（抗）；吉育 24（中抗）；吉育 89（感）； 吉育 47（高感）。 6 鉴定方法 6.1 样本采集 4片复叶后，从顶部采集完全展开的第二个复叶的叶柄，采集时，尽量保护叶柄不受意外机械伤害， 做好标记，每个品种（包括对照品种）至少采集10个叶柄,采回后立即进行菌核病菌碟接种。 6.2 接种体的制备 将长满培养基的病原菌（培养4 d左右的大豆菌核病病原菌PDA培养基取出），用打孔器在菌丝外围 5 ㎜处，用打孔器制成直径在5 ㎜菌碟，备用。 6.3 接种与培养 将消毒后的纱布2 层铺于消毒后的方盘中，用无菌水将纱布刚好浸没，将采集的大豆叶柄先用无菌 水冲洗2 次～3 次，2端用无菌脱脂棉包扎，整齐摆放于纱布上，叶柄间的距离在1 cm 以上，叶柄凹陷 处朝上，用镊子夹取备用的菌碟将菌丝面接种到大豆叶柄中间凹陷处，每个方盘应摆放每个标准对照品 种叶柄至少3 个，方盘摆满后，用保湿膜盖上方盘，置于温度24 ℃～25 ℃，湿度90%的可控温湿度培 养箱中。 7 调查 7.1 2 调查时间和方法 DB22/T 2140—2014 在叶柄菌碟接菌后，24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h定期用游标卡尺测量病斑长度。 7.2 数据统计与分析 根据调查数据，先对每个试验品种调查点调查数据进行数据统计，去除离均差最大的数值，并计算 每个调查点的平均数据，以病斑长度为因变量，接菌时间为自变量按式（1）建立线性回归方程。 y = b0 + b1 x ....................................... (1) 式中： y —— 因变量病斑长度； x —— 自变量接菌时间； b0 —— 常数； b1 ——回归系数。 并以此回归方程计算在接菌后90 h时病斑长度L90h，根据标准对照品种的病斑长度，对试验品种按 下边不等式划分6个等级。见表1 表1 大豆抗菌核病级别划分 发病级别 划分标准 鉴定结果 0 L90h = 0 免疫 1 L90h＜[ L(HR)90+L(R)90 ]/2 高抗 3 [ L(HR)90+L(R)90 ]/2 ≤L90h＜ [ L(R)90+L(MR)90 ]/2 抗 5 [ L(R)90+L(MR)90 ]/2 ≤L90h＜ [ L(MR)90+L(S)90 ]/2 中抗 7 [ L(MR)90+L(S)90 ]/2 ≤L90h＜ [ L(S)90+L(HS)90 ]/2 感病 9 [ L(S)90+L(HS)90 ]/2 ≤L90h 高感 注1：L(HR)90：已知对照品种 高抗品种（吉育35）叶柄在接种菌碟后，通过回归方程计算90 h时的病斑长度 mm； 注2：L(R)90：已知对照品种 抗病品种（吉农21）叶柄在接种菌碟后，通过回归方程计算90 h时的病斑长度 mm； 注3：L(MR)90：已知对照品种 中抗品种（吉育24）叶柄在接种菌碟后，通过回归方程计算90 h时的病斑长度 mm； 注4：L(S)90：已知对照品种 感病品种（吉育89）叶柄在接种菌碟后，通过回归方程计算90 h时的病斑长度 mm； 注5：L(HS)90：已知对照品种 高感品种（吉育47）叶柄在接种菌碟后，通过回归方程计算90 h时的病斑长度 mm； 注6：L90h：试验样品叶柄在接种菌碟后，通过回归方程计算90 h时的病斑长度 mm。 8 抗性评价 8.1 有效性判别 设置的已知对照品种抗、感病表现正常，病斑长度梯次明显，参鉴品种每组样本间调查数据的重复 性良好，视该批次鉴定有效。 8.2 重复鉴定 参鉴材料中初次鉴定表现中抗以上的材料，需进行重复鉴定。 8.3 抗性评价标准 3 DB22/T 2140—2014 根据统计后的试验结果对鉴定材料进行分析评价，抗性等级划分见表1。写出正式鉴定报告，并列 出原始数据。 9 原始数据记录 原始记录按表2进行。 表2 材料 样本 名称 编号 年大豆抗菌核病鉴定结果记载表 叶柄接种菌碟后不同时间的病斑长度（mm） 材料来源 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 鉴定地点： 接种病原菌分离物编号 来源 接种日期 调查日期 鉴定人（签字）： 4 144 h DB22/T 2140—2014 AA 附 录 A （资料性附录） 大豆菌核病 A.1 病原菌及症状 A.1.1 病原菌 大豆菌核病 Sclerotinia sclerotiorum（Lib．）de Bary 称核盘菌，属子囊菌门真菌。菌核圆柱 状或鼠粪状，大小3 mm～7 mm × 1 mm～4 mm，内部白色，外部黑色。子囊盘盘状，上生栅状排列的子 囊。子囊棒状，内含8个子囊孢子。子囊孢子单胞，无色，椭圆形，大小9 μm～14 μm × 3 μm～6 μm。 侧丝无色，丝状，夹生在子囊间。菌丝在5 ℃～30 ℃均可生长，适温20 ℃～25 ℃。菌核萌发温限5 ℃～ 25 ℃，适温20 ℃。菌核萌发不需光照，但形成子囊盘柄需散射光才能膨大形成子囊盘。在马铃薯蔗糖 琼脂培养基上菌丛白色，生长迅速，不久形成黑色鼠粪状菌核。见图 A.1,图 A.2。 菌核萌发形成子囊盘 子囊孢子成熟后弹出 图A.1 子囊及子囊孢子 大豆菌核病病原菌核盘菌 图A.2 大豆菌核病菌核 5 DB22/T 2140—2014 A.1.2 症状 大豆菌核病主要发生在地上部，苗期、成株期均可发病，花期受害重，产生苗枯、叶腐、茎腐、荚 腐等症。苗期染病茎基部褐变，呈水渍状，湿度大时长出棉絮状白色菌丝，后病部干缩呈黄褐色枯死， 表皮撕裂状。叶片染病始于植株下部，初叶面生暗绿色水浸状斑，后扩展为圆形至不规则形，病斑中心 灰褐色，四周暗褐色，外有黄色晕圈；湿度大时易生白色菌丝，叶片腐烂脱落。茎秆染病多从主茎中下 部分枝处开始，病部水浸状，后褪为浅褐色至近白色，病斑形状不规则，常环绕茎部向上、下扩展，致 病部以上枯死或倒折。湿度大时在菌丝处形成黑色菌核。病茎髓部变空，菌核充塞其中。干燥条件下茎 皮纵向撕裂，维管束外露似乱麻，严重的全株枯死，颗粒不收。豆荚染病现水浸状不规则病斑，荚内、 外均可形成较茎内菌核稍小的菌核，多不能结实。见图A.3。 大豆菌核病发病初期症状 大豆菌核病发病中后期症状 图A.3 大豆菌核病植株症状 _________________________________ 6