ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2404—2015 猪丹毒杆菌检验规程 Protocol of examination for swine erysipelas 文稿版次选择 2015 - 07 - 14 发布 安徽省质量技术监督局 2015 - 08 - 14 实施 发 布 DB34/T 2404—2015 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学、安徽省猪病监测工程技术中心提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省猪病监测工程技术中心。 本标准主要起草人：李郁、孙裴、李泉生、钱昌银、魏建忠、檀华蓉、张联合。 I DB34/T 2404—2015 猪丹毒杆菌检验规程 1 范围 本标准规定了猪丹毒杆菌的检验方法。 本标准适用于猪丹毒杆菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14926.43-2001 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂 NY/T 566 猪丹毒诊断技术 3 设备和材料 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4 显微镜：物镜 10 倍～100 倍。 电子天平：感量 0.1 g。 恒温培养箱：36℃±1℃ 冰箱：2℃～5℃。 无菌培养皿：直径 90 mm。 无菌试管：15 mm×150 mm。 无菌锥形瓶：容量 250 mL ，500 mL。 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 培养基与试剂 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 饱和氯化钠溶液：见附录 A 中 A.1。 30％甘油缓冲盐水溶液：见附录 A 中 A.2。 革兰氏染色液：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 3.1 规定。 血液琼脂培养基：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 4.4 规定。 血清琼脂培养基：见附录 A 中 A.3。 马丁肉汤：见附录 A 中 A.4。 磷酸盐缓冲液（PBS）：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 4.13 规定。 糖发酵培养基：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.1 规定。 缓冲葡萄糖蛋白胨水：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.5 规定。 营养明胶：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.14 规定。 蛋白胨水：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.4 规定。 硫酸亚铁琼脂：见附录 A 中 A.5。 1 DB34/T 2404—2015 4.13 4.14 4.15 4.16 5 硝酸盐培养基与硝酸盐还原试剂：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.7 规定。 氧化酶试剂：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.8 规定。 胰蛋白胨水：见附录 A 中 A.6。 马尿酸钠培养基：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.18 规定。 检验程序 猪丹毒杆菌检验程序见图1。 检样 显微镜检查 分离培养 动物试验 直接涂片 血液或血清 琼脂平板 革兰氏染色 马丁肉汤 选取可疑菌 落涂片镜检、 纯培养 镜检 PCR鉴定 生化反应 临症表现 病理变化 染色镜检 分离培养 猪丹毒杆菌 血清型鉴定 结果报告 图1 猪丹毒杆菌检验程序 6 操作步骤 6.1 采样、运输和保存 6.1.1 急性败血型猪丹毒可采取肾、脾、肝、心血、淋巴结；亚急性疹块型猪丹毒可采取疹块及其周 围皮肤；慢性型猪丹毒可采取肿胀的关节液、心脏瓣膜增生物。 6.1.2 脏器组织样品采集后需延迟送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或 30％甘油缓冲盐水溶液中，保 存时间不超过 72 h。 6.1.3 样品均需采取低温（0～4℃）保存和运输。 6.2 显微镜检查 2 DB34/T 2404—2015 6.2.1 采集的样品制成涂片，革兰氏染色，镜检。 6.2.2 猪丹毒杆菌形态学特征 革兰氏阳性小杆菌，在动物组织中呈断发状小短杆菌体，大小为 0.2～ 0.4×0.8～2.5 μm，无芽孢，无荚膜，无鞭毛，常单独或排列成短链，在慢性病例的动物体内或陈旧培 养基中呈现细长弯曲的长丝状。 6.3 分离培养 6.3.1 对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼脂培养基上，37℃培养 24～48 h。或 经马丁肉汤 37℃培养 24 h 后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，37℃培养 24 h。 6.3.2 如被检材料已腐败或被污染，可在上述培养基中加入 1/100 万结晶紫和 1/5 万叠氮钠，或加入 新霉素（400 μg/mL）或万古霉素（70 μg/mL），抑制其他杂菌生长。 6.3.3 在血清琼脂上菌落特征 细小、圆形、透明、凸起、灰白色、有光泽、质软、露珠样、易混悬 于盐水中。 6.3.4 在血液琼脂上菌落特征 同 6.3.3，并形成绿色的狭窄溶血环（α溶血）。 6.3.5 在马丁肉汤中生长特征 轻度混浊，振动试管呈现出云雾状，有少量灰白色粘稠沉淀，不形成 菌膜和菌环。 6.4 生化反应试验 糖发酵反应常不规则，一般可分解葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖，产酸不产气；不分解木糖、麦芽 糖、甘露醇、蔗糖。产生硫化氢，不液化明胶，不使硝酸盐还原为亚硝酸盐，不形成靛基质，甲基红、 V-P、接触酶、氧化酶试验均为阴性。 6.5 动物试验 6.5.1 猪丹毒杆菌对小白鼠、大白鼠、家兔、鸽均有致病力，以小白鼠最敏感。 6.5.2 将肾、脾、肝、淋巴结和疹块部皮肤磨碎，用灭菌生理盐水制成 1:5～1:10 组织悬液，或将 24 h 的肉汤纯培养物做动物试验用。小白鼠皮下注射组织悬液 0.2 mL 或纯培养菌液 0.1 mL，接种后 小鼠出现精神萎顿、拱背、毛乱、停食，3～7 天死亡；死亡的小鼠脾肿大，肺和肝充血，肝有时可见 小点坏死。以死亡小鼠的心血或脏器制成涂片，革兰氏染色，镜检，可见大量猪丹毒杆菌；同时在血液 琼脂或血清琼脂培养基上作分离培养，可见猪丹毒杆菌的典型菌落。 6.6 PCR 鉴定 见附录B。 6.7 血清型鉴定 若需鉴定血清型时可按照 NY/T 566 的规定执行。 7 猪丹毒杆菌与产单核细胞李斯特菌鉴别要点 猪丹毒杆菌与产单核细胞李斯特菌均为革兰氏阳性的细小杆菌，形态很相似，因此在鉴定中应注 意区别，两种细菌的区别应符合表1 的规定。 3 DB34/T 2404—2015 表1 猪丹毒杆菌与产单核细胞李斯特菌鉴别要点 菌名 猪丹毒 杆菌 溶血 4℃ 运动性 触 七叶苷 马尿 VP及甲基 新生 明胶 型 生长 （25℃） 酶 水解 酸钠 红试验 霉素 穿刺 α － － － － － － 抵抗 产单核 细胞李 刷状 鸽 豚鼠 ＋ － － ＋ 沿穿 β 斯特菌 8 试管 感染试验 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 敏感 刺线 生长 结果报告 8.1 综合以上形态、结构与染色，培养特性，生化反应，动物试验，PCR 鉴定，血清学分型鉴定及其 与产单核细胞李斯特菌的鉴别结果，进行报告。 8.2 符合 6.2、6.3、6.4、6.5，可确定为猪丹毒杆菌。 8.3 符合 6.3、6.6，可确定为猪丹毒杆菌。 8.4 符合 8.1、8.2，且根据 6.7，可确定为某种血清型的猪丹毒杆菌。 4 DB34/T 2404—2015 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基的配制 A.1 饱和氯化钠溶液 A.1.1 成分 氯化钠 蒸馏水 38～39 g 100 mL A.1.2 制法 将 38～39 g 氯化钠加入 100 mL 蒸馏水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，分装于采样管，每管 5～10 mL，121℃高压灭菌 15 min 备用。 A.2 30％甘油缓冲盐水溶液 A.2.1 成分 氯化钠 碱性磷酸钠 中性甘油 蒸馏水 0.5 g 1.0 g 30 mL 100 mL A.2.2 制法 先将盐类成分溶于水中，然后加入甘油，混匀，分装于采样管，每管 5～10 mL，121℃高压灭菌 15 min 备用。 A.3 血清琼脂培养基 A.3.1 成分 营养琼脂 pH 7.6 血清（兔、牛、羊或马） 100 mL 5～10 mL A.3.2 制法 将营养琼脂加热溶化，冷至约 55℃时，以无菌操作，加入无菌血清，然后倾注平皿备用。 A.4 马丁肉汤 A.4.1 成分 蛋白胨液 500 mL 5 DB34/T 2404—2015 肉浸液 冰乙酸 乙酸钠 葡萄糖 500 mL 1 mL 6 g 10 g A.4.2 制法 将蛋白胨液与肉浸液混合，加热至 80℃，加冰乙酸 1 mL，摇匀，再煮沸 5 min。加 15％氢氧化 钠约 20 mL，校正 pH 7.2。加乙酸钠 6 g，再校正 pH 7.2。继续煮沸 10 min，用滤纸过滤，每 1000 mL 滤液加葡萄糖 10 g，然后装瓶，每瓶 500 mL。121℃高压灭菌 15 min 备用。 A.5 硫酸亚铁琼脂 A.5.1 成分 酵母浸膏 蛋白胨 硫酸亚铁 硫代硫酸钠 氯化钠 琼脂 蒸馏水 pH 7.4 3 g 10 g 0.2 g 0.3 g 5 g 12 g 1000 mL A.5.2 制法 加热溶解，校正 pH，分装试管，115℃高压灭菌 15 min，取出直立候其凝固。 A.6 胰蛋白胨水 A.6.1 成分 胰蛋白胨 蒸馏水 pH 7.0 10 g 1000 mL A.6.2 制法 将上述成分溶解，校正 pH，分装试管。121℃高压灭菌 15 min 备用。 6 DB34/T 2404—2015 BB 附 录 B （规范性附录） 猪丹毒杆菌聚合酶链式反应（PCR）鉴定 B.1 材料准备 B.1.1 主要仪器 PCR 扩增仪、1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 反应管、水浴锅、高速冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像 系统、移液器、移液器吸管。 B.1.2 主要试剂 2×PCR Master Mix、双蒸水、琼脂糖、10 mg/ML 溴化乙锭（EB）、TBE 缓冲液、上样缓冲液（10×Loading Buffer）、相对分子质量 Marker（DL-2000）。 B.1.3 引物序列 P1：5′-CGATTATATTCTTAGCACGCA