ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2560—2016 水貂病毒性肠炎检疫技术规范 Quarantine protocol for mink viral enteritis 2016 - 12 - 09 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 03 - 01 实施 发 布 DB22/T 2560—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口于吉林省畜牧业管理局。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中国农业科学院特产研究所。 本标准主要起草人：王伟利、王建科、孟庆峰、程悦宁、易立、姚贵哲、王准、宋翱、程世鹏。 I DB22/T 2560—2016 水貂病毒性肠炎检疫技术规范 1 范围 本标准规定了水貂病毒性肠炎的病原分离鉴定、HA-HI试验、PCR、Real-time PCR及动物回归试验 等诊断技术要求。 本标准适用于水貂病毒性肠炎的检疫、疫情监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 MEV：水貂肠炎病毒 F81：猫肾传代细胞 CPE：细胞病变 Real-time PCR：实时荧光定量PCR PBS：磷酸盐缓冲液 HA：血凝试验 HI：血凝抑制试验 4 4.1 材料与试剂 材料 ——注射器（5 mL、20 mL） ——吸管（5 mL、10 mL） ——离心管（1.5 mL、0.2 mL） ——吸头 ——96 孔微量血凝板 ——细胞培养瓶 ——PCR 管 ——试验动物：3 月龄健康水貂（水貂肠炎病毒 HI 抗体效价≤ 1∶4） 4.2 试剂 ——DEPC 双蒸水（双蒸馏水 1000 mL、DEPC 1 mL，室温放置 28 h 以上，0.105 MPa 蒸汽高压 30 min。 1 DB22/T 2560—2016 4 ℃或室温保存） ——培养液（DMEM 粉 10 g、碳酸氢钠 3.7 g，溶于 1000 mL 双蒸水中，抽滤分装，4 ℃保存） ——营养液（DMEM 培养液 900 mL、犊牛血清 100 mL，加青霉素、链霉素， 使其浓度分别达到 200 IU/mL、 200 µg/mL 抽滤除菌） ——维持液（DMEM 培养液 980 mL、犊牛血清 20 mL，加青霉素、链霉素使其终浓度分别达 200 IU/mL、 200 µg/mL，抽滤除菌） ——胰 蛋 白 酶 溶 液 （ 胰 酶 2.50 g 、 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 （ EDTA ） 0.20 g 、 无 钙 镁 PBS 1000 mL，抽滤除菌，4 ℃保存备用） ——新生犊牛血清 ——青霉素 ——链霉素 ——阿氏液（葡萄糖 2.05 g、拘椽酸钠 0.8 g、柠檬酸 0.055 g、氯化钠 0.82 g、双蒸馏水二级水 中溶解后，用盐酸将 pH 值调至 6.1，高压蒸汽灭菌 20 min，最后用二级水定容至 100 mL，4 ℃保存备用。） ——蛋白酶 K （三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH 7.8） 1.20 mg（0.01 mmol/L）、乙二胺四乙酸 （EDTA）1.86 mg（0.005 mmol/L）、 SDS 5.00 g、三蒸水 1 000 mL、加入蛋自酶 K，使成为 20 mg/mL，即为贮存液；使用浓度为 50 µg/mL） ——RNase A（20 µg/mL，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）1.21 g、15 mmol/L NaCl 0.89 g、RNase A 0.02 g，加去离子水使其终浓度为 20 µg/mL。分装，－20 ℃保存备用） ——Tris 饱和酚 ——酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1） ——无水乙醇 ——70 %乙醇 ——TE（pH 8.0）（10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）1.21 g、l mmol/L EDTA（pH 8.0）0.37 g、去 离子水 800 mL，调节 pH 至 8.0，用去离子水定容至 1000 mL） ——Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） ——dNTPs（每种浓度均为 10 mmol/L） ——RNasin（40 U/μL） ——MgCl2（15 mmol/L） ——琼脂糖（电泳级） ——DNA Marker DL 2000 ——50×Tris-冰乙酸（TAE）电泳缓冲液（Tris 282.0 g、冰乙酸 57.10 g、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）100 mL，三蒸水定容至 1000 mL，0.105 MPa 蒸汽高压 30 min，备用） ——溴化乙锭溶液（10 mg/mL）（三蒸水 100 mL、溴化乙锭 1 g，置棕色瓶中，磁力搅拌数小时以 确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器保存于室温） ——1%琼脂糖凝胶（琼脂糖 1 g、TAE 电泳缓冲液（50 倍）2 mL、灭菌三蒸水 98 mL、微波炉中完 全融化，加溴化乙锭溶液） ——SYBR® Premix，商品化的荧光定量 PCR 试剂盒可以用来进行荧光定量 PCR 反应体系的配制 ——F81 传代细胞 ——猪的红细胞：1 %猪红细胞悬液（用 20 mL 注射器先吸取 5 mL 阿氏液，从健康猪耳静脉采血 10 mL 左右立即混匀，用 pH 值 6.4 的 PBS 洗涤，3000 r/min 离心 5 min，弃掉上清，反复洗 涤 3 次，直至离心后的 PBS 无血色，弃上清，取出红细胞泥 1 mL，加含 1 % BSA 的 pH 值 6.4 的 PBS 稀释液 9 mL，混匀后取 1 mL，稀释液 9 mL，即为 1 %的猪红细胞悬液） 2 DB22/T 2560—2016 ——阳性抗原：由指定单位提供或将水貂肠炎病毒疫苗毒 MEV B 株通过 F81 传代细胞培养，其培养 物经过灭活制备而成 ——阴性抗原：由指定单位提供或将生长良好的 F81 传代细胞，冻融 2～3 次，5000 r/min 离心 10 min，取上清液备用 ——阳性血清：由指定单位提供或用水貂肠炎病毒疫苗株的细胞培养物免疫水貂后分离血清制成， 或采已知水貂肠炎病毒抗体阳性貂血分离而成 ——引物：根据 MEV 国际标准株 Abashiri 基因序列，在其保守基因序列内设计合成一对特异性引 物：引物 P1：5’ –ACAAGCGGCAAGCAATCCTC– 3’， 引物 P2：5' –CTGCCTCTATTTCGGACCAT– 3'， 配制成 20 pmol/µL。–20 ℃保存 5 设备 ——生物安全柜 ——CO2 培养箱 ——倒置显微镜 ——高速冷冻离心机 ——组织匀浆器 ——4 ℃冰箱 ——超低温冰箱 ——PCR 扩增仪 ——电泳仪 ——电泳槽 ——凝胶成像分析系统 ——荧光定量 PCR 仪 ——旋涡振荡器 ——移液器（20 μL、200 μL、1000 μL） ——8 通道移液器（100 μL） 6 病毒分离鉴定 6.1 病料采集与处理 无菌取病貂的肠道组织或粪便2 g，按1:10的比例用培养液制成匀浆，反复冻融三次，3000 r/min 离心20 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，加入抗生素至终浓度为青霉素2000 IU/mL，链霉素2000 µg/mL，37 ℃ 感作1 h，冷藏备用。 6.2 病料接种 将处理过的样品同步接种F81细胞，接种量为营养液量的10 %，加入营养液，然后37 ℃恒温培养 箱中吸附24 h后，倾去营养液加入维持液，置37 ℃的5 % CO2恒温培养箱中培养4 d～6 d，同时设置正 常细胞对照。 6.3 病变观察 3 DB22/T 2560—2016 接种24 h后置显微镜下逐日观察至4 d～6 d。正常细胞对照成立，接种病料的细胞出现细胞变圆、 拉网、脱落等CPE，收获细胞培养物，放入–80 ℃冰箱中保存备用。对照细胞与接种样品细胞均无变化， 应盲传3代。盲传过程中出现CPE，按上述原则，收获细胞培养物，放入–80 ℃冰箱中保存备用；若盲传 3代未出现CPE，则按未分离到水貂肠炎病毒出具结果。 6.4 病毒鉴定 取上述细胞培养物进行HA-HI试验、PCR、荧光定量PCR和动物回归试验等鉴定。 7 HA-HI 试验 7.1 样品采集与处理 7.1.1 组织与粪便 无菌取病貂的肠道组织或粪便2 g，按1:20的比例用培养液制成匀浆，反复冻融三次，3000 r/min 离心20 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，加入抗生素至终浓度为青霉素2000 IU/mL，链霉素2000 µg/mL，冷藏备用。 7.1.2 血清制备 趾尖采血，室温静置1 h后4 ℃冰箱过夜，吸出血清入离心管中，3000 r/min离心5 min，取上清液 备用。 7.2 HA 试验 7.2.1 加样步骤 在微量板上，从第1孔至10孔以及12孔，用移液器每孔加入pH 6.4 10 mM的PBS 25 μL，用移液器 吸取7.1.1待检样品25 μL，从第1孔起，依次作倍比稀释，至第10孔，弃去移液器内25 μL液体（稀释 倍数依次为2、4、8、16、32… 1024），11孔为病毒对照，12孔为红细胞对照。第1孔至12孔每孔补加 pH 6.4的 PBS 25 μL，再加入1%猪红细胞悬液50 μL，立即在微量板振荡器上摇匀后放置4 ℃静置 60 min 判定结果。加样示意图参见附录A.1。 7.2.2 结果判定 使50 ％红细胞凝集的最高稀释度，作为病毒的HA效价；HA效价≥1:8则判定为HA阳性，反之则为阴 性。 7.3 HI 试验 7.3.1 4 个单位血凝素的配制 病毒HA效价（如为1∶256），4个血凝工作单位=256/4=64（即1∶64），取pH 6.4的 PBS 9 mL，加 血凝素 l mL，即成1:10稀释度，将1:10稀释液l mL加入到生理盐水5.4 mL中，使最终浓度为1:64。 7.3.2 加样步骤 将待检血清用pH 6.4的PBS进行2倍系列稀释，加入含4单位血凝素的抗原液，并设红细胞对照和病 毒对照，充分振摇后，置37 ℃作用30 min后，加入1 %红细胞悬液，4 ℃静置60 min，判定结果。加样 示意图参见附录A.2。 4 DB22/T 2560—2016 7.3.3 判定标准