ICS 65.020 B 05 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2812—2017 番茄细菌性溃疡病病原检测 LAMP 法 Detection for bacterial canker of tomato pathogen — LAMP method 2017 - 12 - 11 发布 吉林省质量技术监督局 2018 - 04 - 01 实施 发 布 DB22/T 2812—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009 和 GB/T 20001.4—2015给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林省蔬菜花卉科学研究院。 本标准主要起草人：毛芙蓉、王利波、刘燕妮、郑士金、李欣敏、潘博、郑建超、王剑锋、娄琦、 王志琴。 I DB22/T 2812—2017 番茄细菌性溃疡病病原检测 LAMP 法 1 范围 本标准规定了番茄细菌性溃疡病病原 LAMP 检测的原理、试验条件、试剂或材料、仪器设备、样 品、试验步骤、试验结果观察、质量保证和控制、试验报告。 本标准适用于番茄种苗、植株和果实中番茄细菌性溃疡病病原的定性快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 NY/T 2286 番茄溃疡病菌检疫检测与鉴定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 番茄细菌性溃疡病 bacterial canker of tomato 由密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis）引起的一种 维管束病害，从番茄苗期到收获期均可发病。该病害病原的分类地位、寄主范围、地理分布、危害症 状及传播途径参见附录 A。 3.2 环介导等温扩增 loop-mediated isothermal amplification ( LAMP ) LAMP 是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异引物，在 BstDNA 聚合酶作用下，以特异性引物为延伸起点，在 60℃～65℃ 恒温条件下通过链置换反应进行的 DNA 扩增方法，扩增产物是一系列复杂的大小不等的 DNA 混合物。 4 4.1 原理 一般原理 根据番茄细菌性溃疡病原的特异性基因 tomA 的核苷酸序列（GenBank 登录号为 HE861510）， 设计 LAMP 内引物、外引物和环引物各一对，特异识别 tomA 基因的六个独立区域。在反应溶液中加入 含有靶标核苷酸序列的 DNA，在 Bst DNA 聚合酶的作用下启动链置换反应，生成茎环 DNA 混合物。扩 增反应结束后加入 SYBR Green I 荧光染料，即可通过产物双链 DNA与染料结合后颜色变化，观察判定 结果。 1 DB22/T 2812—2017 4.2 显色原理 SYBR Green I 是一种高灵敏度的 DNA 荧光染料，可以嵌入方式结合到双链 DNA 的小沟内。当它 与双链 DNA 结合时，荧光信号是游离状态的 800～1 000 倍。在不发生扩增反应时，SYBR 染料分子的 荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链 DNA 的增加，SYBR 染料的荧光 信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链 DNA 分子的数量，同时颜色由橙色变成绿色。 5 试验条件 常规实验室条件。 6 试剂或材料 6.1 LAMP 引物，包括外引物 1、外引物 2、内引物 1、内引物 2、环引物 1 和环引物 2，其核苷酸 序列分别为： ——外引物 ——外引物 ——内引物 ——内引物 ——环引物 ——环引物 1：5’-CGCTGGGCTTGACCGA-3’ 2：5’-CCCACCGATCGATCCTTCC-3’ 1：5’-TACTCCGGATCGCAGCAGCTAGAGCACGACATGGCGG-3’ 2：5’-CGTGACCTCGATCACGGATGCGTAACGCTCCATCACAGTGG-3’ 1：5’-GGAGATCAGACCATGGCCCTTTA-3’ 2：5’-GCGGCGATGACAGAGCA-3’ 注：引物纯度以HPLC级为宜。 6.2 引物混合溶液：配制 6.1 中所列引物混合溶液，外引物 1、外引物 2、内引物 1、内引物 2、环 引物 1 和环引物 2 的浓度依次为 5 µmol/L、5 µmol/L、40 µmol/L、40 µmol/L、5 µmol/L 和 5 µmol/L。 6.3 Bst DNA 聚合酶：浓度为 8 U/μL。 6.4 10×LAMP 反应缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl （pH 8.8）、100 mmol/L KCl、100 mmol/L (NH4)2SO4、80 mmol/L MgSO4、8 mol/L 甜菜碱。 6.5 dNTPs 溶液：由浓度均为 10 mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液 等体积混合而成。 6.6 显色剂：1000 × SYBR Green I 荧光染料。 6.7 水：重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的二级水。 6.8 细菌 DNA 提取试剂盒。 7 仪器设备 7.1 7.2 7.3 8 离心机，离心力 12 000 Xg 以上。 恒温水浴锅。 移液器。 样品 8.1 2 取样 DB22/T 2812—2017 应按 NY/T 2286 的规定执行。 8.2 样品制备 按 8.1 取样方法取 5 g 样品加 10 mL 灭菌去离子水研磨至细胞匀浆，4000 Xg 离心，取上清液。 9 试验步骤 9.1 试样 DNA 提取：按细菌 DNA 提取试剂盒说明书，提取样品中的细菌 DNA。 9.2 LAMP 反应溶液配制：在 200 μL 反应管内依次加入灭菌去离子水或超纯水 13.5 μL、试样 DNA 2 μL、检测引物混合溶液 1 μL、Bst DNA 聚合酶 1 μL、10×LAMP 反应缓冲液 2.5 μL、dNTPs 溶液 5 μL， 用移液器吸头吹打混匀。在反应管盖内侧中央位置加入 2 μL 显色剂，盖紧管盖。 9.3 LAMP 反应及条件：将反应管在恒温水浴锅中 63 ℃ 孵育 40 min 进行反应，然后 80 ℃ 孵育 5 min，终止反应。 10 试验结果观察 反应终止后，上下颠倒混匀反应管内液体，通过观察颜色判断试验结果（参见附录 B）： ——反应溶液显现绿色为阳性； ——反应溶液显现橙色为阴性。 11 质量保证和控制 11.1 质控样品设置 11.1.1 在试样 LAMP 扩增的同时，应设置 LAMP 阳性对照和空白对照。 11.1.2 以番茄溃疡病病原 DNA 作为阳性对照，以水作为空白对照。 11.1.3 除模板外，对照 LAMP 扩增与试样 LAMP 扩增相同。 11.2 防污染措施 应按 GB/T 27403 的规定执行。 12 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容： ——样品名称； ——所使用的标准（包括发布或出版年号）； ——结果； ——观察到的异常现象； ——试验日期。 3 DB22/T 2812—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 番茄细菌性溃疡病病原背景资料 A.1 病原学名 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis A.2 病原中文名 密执安棒形杆菌密执安亚种。 A.3 病原分类地位 该病原属于细菌域、放线菌门、放线菌纲、放线菌目、微杆菌科、棒形杆菌属。 A.4 病原寄主范围 主要寄主是番茄、辣椒、烟草、裂叶茄和其他茄科植物。 A.5 地理分布 该病害于 1909 年首次在美国密执安州的温室番茄上被发现，现已广泛分布于世界 60 多个国家和 地区。 A.6 危害症状 主要症状表现为叶缘坏死，茎部条斑，茎杆中空、开裂，维管束变色，果实表面形成“鸟眼”斑， 后期植株萎蔫死亡。 A.7 传播途径 病原通过种子、种苗及未加工果实的运输远距离传播，通过农事操作和雨水灌溉近距离扩散传播。 4 DB22/T 2812—2017 BB 附 录 B （资料性附录） 试验结果判断 注：1. 阳性, 2～8. 阴性 图B.1 LAMP 特异性检测结果 _________________________________ 5