ICS 65.020.20 B16 备案号： 江 DB32 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3487—2018 黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程 Technical Specification for the Seedling Detection of Cucumber Green Mottle Mosaic Virus 2018-11-9 发布 江苏省质量技术监督局 2018-11-30 实施 发布 DB32/T 3487—2018 前 言 本标准按 GB/T 1.1—2009《标准化工作导则第 1 部分：标准的结构及编写》的规定编写。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：程兆榜、任春梅、季英华、杨柳、缪倩、周益军。 I DB32/T 3487—2018 黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程 1 范围 本标准规定了苗床期瓜苗黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测条件、检测技术、结果判定和结果记载。 本标准适用于苗床期症状尚未表现的瓜类作物上黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的的修改单）适用于本文件。 GB/T 35335 黄瓜绿斑驳花叶病毒病监测规范 SN/T 2964 植物病毒检测规范 3 检测条件 3.1 主要试剂 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钾（KCl）、氢氧化钠（NaOH） 、碳酸氢二 钠（Na2HCO3）、氯化钠（NaCl）、叠氮化钠（NaN3）、PVP-400、鸡卵清蛋白、无水亚硫酸钠（Na2SO3）、 吐温-20、焦碳酸二乙酯（DEPC） 、溴百里酚蓝、乙二醇、Tris 碱、Tris-HCl、硼酸、EDTA、无水乙醇、 琼脂糖、DIG DNA Labeling Kit、CGMMV 抗体。PCR 试剂和检测过程中所需溶液配方，参见附录 A。 除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。 3.2 用具及仪器 用具耗材：移液器、一次性手套、牛皮纸袋、标签纸、记号笔等 仪器设备：高压灭菌锅、培养箱、高速冷冻离心机（规格：-6℃~ 20℃、最高转速 12000 转/分以上）、 电泳仪（规格：电压 50~120 V、电流 10~800 mA）、PCR 仪、凝胶成像系统、超纯水仪。 4 检测技术 4.1 采样方法 4.1.1 采样时间 待检材料为嫁接或未嫁接的黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等瓜类作物幼苗，采样时间为出厂定植前 3 天~7 天植株处于 2 片~4 片真叶期。 4.1.2 采样部位 植株最上部半展开-展开的心叶，心叶未达要求时取位于心叶下部一张完全展开叶。 4.1.3 取样方法 五点法取样，一株为一个样本，不同品种或同一品种不同时间播种的为不同批次，每批次样本数量 不小于 200 株或同批次苗的 0.1%。样本采集时使用一次性手套单株采集并临时保存在一次性手套中。 1 DB32/T 3487—2018 4.1.4 样品处置 取样后叶片一分为二，一半为检测样品、一半为留存样品。样品用吸水纸包裹置于透气牛皮纸袋中， 新鲜检测样品在 4℃下临时保存 3 天内检测完毕，如不能在 3 天内检测则将样品于-20℃的条件下冰冻 保存。留存样品室温下荫干-20℃的条件下冰冻保存一年后，确认不再需要时焚烧或深埋处置。 4.2 检测方法 4.2.1 样品处理 称取 0.1 g 待检样品叶片，加入适量液氮充分研磨成粉末后加入 10 倍体积的通用样品处理缓冲液（见 附录 A）溶解，10000 转/分离心 5 分钟，上清即为样品提取液。同一批样品中加入具典型斑驳花叶症状 并经 PCR 法鉴定确认为 CGMMV 的病样稀释 1000 倍为阳性对照、经 PCR 法确认无 CGMMV 的健康 叶片为阴性对照。 4.2.2 免疫捕获 4.2.2.1 用碳酸盐包被缓冲液（见附录 A）稀释黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗血清 500 倍，取稀释后的抗血 清 30μL 包被 PCR 管，4℃孵育过夜或 37℃下放置 2h。 4.2.2.2 弃包被缓冲液，用洗涤缓冲液（见附录 A）洗涤 3 次~4 次，加入 50μL 样品提取液，37℃孵育 2h。 4.2.2.3 弃样品提取液，用洗涤缓冲液洗涤 3 次~4 次，再用无菌去离子水洗一次，吸尽管底余液后直接 在包被了病毒的 PCR 管中进行反转录。 4.2.3 反转录 4.2.3.1 CGMMV 特异性引物的设计及合成 根据 CGMMV 分离物（Genbank 序列号 DQ217778）序列 设计一对用于扩增 CGMMV-cp 基因的特异性引物：F: 5′- ATGGCTTACAATCCGATCAC-3′；R: 5′TGGGCCCCTACCCGGGGAAAAG-3′，-20℃保存。 4.2.3.2 反转录体系及操作 在免疫捕获后的 CR 管中加入 CGMMV 3’端引物 1 μL，DEPC 水 9 μL， 65℃变性 5 min，取出置于冰上 5 min，再依次加入下列试剂：5×M-MuLV 反转录酶缓冲液 2 μL，40 mmol/L dNTPs（每种 10 mmol/L）0.5 μL，RNasin（40 U/μL）0.5 μL，M-MuLV 反转录酶（20 U/μL） 0.5 μL，42℃水浴 1h，70℃灭活 10min，-20℃保存备用。 管，参照 NY/T 2288-2012 中 7.4 的要求进行，并略有改进。 具体操作参见附录 B。 4.2.4 PCR 以反转录合成的 cDNA 第一条链为模板，进行 PCR 扩增，扩增反应体系 25 μL。 25 μL PCR 标准 反应体 系：10×Taq PCR Buffer(With Mg2+) 2.5 μL， 40 mmol/L dNTPs（每 种 10 mmol/L）0.5 μL，Taq DNA Polymerase(5u/ul) 0.5 μL，CGMMV 上游引物（10μmol /L）0.5 μL，CGMMV 下游引物（10μmol /L）0.5 μL， cDNA 3 μL 和 DEPC 水 17.5 μL。 PCR 反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性 50 s，53℃退火 50 s，72℃延伸 1 min，循环 30 次； 72℃延伸 10 min。 上述 PCR 结束后，每个 PCR 管中取出 1μL 加入新 PCR 管中，采用同样的 25 μL PCR 标准反应体 系和 PCR 反应程序再次进行 PCR 扩增。 5 结果判定 7.1 电泳检测 配制 1%琼脂糖凝胶，将 PCR 产物 3 μL 与上样缓冲液 3μL 混合加入样品孔中，100V 电泳 30 分钟。 核酸染料染色 15min，凝胶成像系统拍照观察。 2 DB32/T 3487—2018 7.2 结果判定 观察琼脂糖凝胶电泳（参见附录 B）结果，阳性对照在 660 bp 处有条带出现，且阴性对照无条带 出现的前提下，待测样品在 660 bp 处有条带出现，即可判定样品携带 CGMMV；否则为阴性反应，即 样品不携带 CGMMV。 当样品检测为阳性时，按 GB/T 35335 规定执行。 8 结果记载 将实验室检测鉴定结果记载于表 1（瓜苗携带黄瓜绿斑驳花叶病毒检测结果记录表） （见附录 B）， 记录保存 1 年以上。 3 DB32/T 3487—2018 附 录 A (资料性附录) 试剂及配制方法 A.1 免疫捕获缓冲液 A.1.1 洗涤缓冲液（Wash Buffer, 0.01M PBST) 称取 8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、3 g Na2HPO4 溶化于 800 mL 无菌去离子水中，再加入 0.5 mL Tween-20 定溶于 1000 mL，即为 0.01M PBST，4℃保存。 A.1.2 通用样品处理缓冲液（General Extract Buffer） 称取 2 g 鸡卵清蛋白，1.3 g 无水亚硫酸钠，20 g PVP-400 和 0.2 g 叠氮化钠，加入 1000 mLA.1.1 所述 0.01M PBST 中，再加入 10mL Tween-20，4℃保存。 A.1.3 碳酸盐包被缓冲液（Coating buffer, 0.5M) 称取 1.59 g 无水 Na2CO3 和 2.93 g NaHCO3，加水定容至 1000 mL，用 HCl 调节 pH 值至 9.6，4℃保存。 A.2 RT-PCR 试剂 A.2.1 RT-PCR 分子试剂 TaqDNA 聚合酶、dNTP、购自大连宝生物公司。反转录酶 M-MLV、RNA 酶抑制剂购自 Promega 公司，-70℃保存。 A.2.2 电泳缓冲液 TBE 在 1000 mL 去离子水中加入 Tris 碱 54 g、硼酸 27.5 g、20 mL 0.5 M EDTA（pH8.0），使用时利用去 离子水 10 倍稀释，即为 0.5×TBE。 A.2.3 琼脂糖凝胶 在 0.5×TBE 工作液中加入 1% (w/v)的琼脂糖，融化，冷却至 60℃倒入插入梳子的制胶槽中，冷却 凝固后点样电泳。 A.2.4 上样缓冲液 取溴百里酚蓝 0.025 g，乙二醇 3 g，加 10 mL 蒸馏水。 4 DB32/T 3487—2018 附 录 B (资料性附录) 检测结果记载表 表1 瓜苗携带黄瓜绿斑驳花叶病毒检测结果记录表 样品采集 样品采集 样品种类 测定样品 日期 地点 第一次PCR结果 第二次PCR结果 阳性样品 阴性样品 带毒株率 阳性样品 阴性样品 带毒株率 鉴定技术负责人 与名称 数量（株） 数（株） 数（株） (%) 数（株） 数（株） (%) 5