ICS  65.020.20 B 16 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2814—2017 玉蜀黍赤霉检疫鉴定方法 Detection and identification of Gibberella zeae (Schwein .)Petch 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 安徽省质量技术监督局 2017 - 04 - 30 实施 发 布 DB34/T 2814—2017 前    言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院。 本标准主要起草人：李云飞、陈雪娇、宗凯、孙娟娟、郑海松、姚剑、余晓峰、王满满。 I DB34/T 2814—2017 玉蜀黍赤霉检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了玉蜀黍赤霉的检疫鉴定方法。 本标准适用于小麦、玉米、水稻等禾谷类作物中玉蜀黍赤霉的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 玉蜀黍赤霉基本信息 学名：Gibberella zeae (Schwein .)Petch 分类地位：真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目 (Hypocreales)，丛赤壳科(Nectriaceae)，赤霉属（Gibberella）。其无性阶段为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)。 传播途径：气流、雨水等是玉蜀黍赤霉病菌近距离传播的主要途径，受侵染的种子及病残体等植物 性材料的调运是远距离传播主要途径。 4 方法原理 根据玉蜀黍赤霉在寄主上的为害症状（参见附录A），培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子等形 态特征，以及 PCR 特异扩增片段大小进行结果判定。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR 仪、凝 胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。 5.2 主要试剂 5.2.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682 的规定。 5.2.2 1％次氯酸钠。 5.2.3 DNA 提取试剂：DNA 提取试剂盒， CTAB 裂解液（20 g/L CTAB，0.1 mol/L Tris，1.4 mol/L Nacl， 20 mmol/L EDTA-Na2），蛋白酶 K（20 mg/mL），苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，3 mol/L NaAc(pH 5.2)，异丙醇，70％乙醇，无菌水。 1 DB34/T 2814—2017 5.2.4 PCR 试剂：10×PCR buffer（含 25 mmol/L MgCl2），Taq 酶，dNTP。 5.2.5 凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，Loading Buffer，EB。 5.2.6 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，氯霉素 0.1 g，琼脂 13.0 g，蒸馏水定容至 1000 mL，调整 pH 值至 5.6 ，121℃高压灭菌 15 min。 6 病菌的鉴定 6.1 分离培养 6.1.1 种子病原菌的分离培养 取 50 g 种子置于无菌水中室温浸泡处理 1 d，转入 -20℃下冷冻处理 1 d，1％次氯酸钠消毒 60 s，无菌水洗涤 3 次后，灭菌滤纸吸干水分后按 15 粒/皿置于 PDA 培养基上，在 25℃～28℃，12 h 黑 暗/12 h 光照（12 h 光暗交替）条件下培养，第 3 d 开始观察，根据种子周围新生菌落的形态和颜色 进行选取,取边缘菌丝转接纯化。 6.1.2 植株病原菌的分离培养 用解剖刀取植株病健交界处的组织，剪成约 0.4 cm×0.4 cm 小段，用 1％的次氯酸钠溶液消毒 60 s，无菌水洗涤 3 次，灭菌滤纸吸干水分后置于 PDA 培养基上，同 6.1.1 培养纯化。 6.2 鉴定特征 PDA 培养基上菌落圆形，生长速度较快；气生菌丝较多，个别呈稀疏、絮状，初期白色，然后白至 玫瑰色、白至洋红色或白至砖红色，中央常遗留黄色气生菌丝区；平板背面深洋红色或淡砖红至赭色。 分生孢子近镰刀形、纺锤形、披针形，稍弯，两端稍窄细，顶端细胞末端稍尖或略钝，基部有明显的踵 状足胞，大多数 3～5 隔，极少数 1～2 隔或 6～7(～9)隔，单个孢子无色，聚集时呈粉红色粘稠状， 3 隔的分生孢子 28 μm～40 μm×4 μm～5 μm、5 隔的分生孢子 30 μm～55 μm×4 μm～5.5 μm、6～7(～ 9)隔的分生孢子 45 μm～60 μm×4.5 μm～6 μm。子囊壳卵圆形或圆锥形，深蓝至紫黑色，顶端有瘤状 突起为孔口，大小 100 μm～250 μm×150 μm～300 μm；子囊呈棍棒状，两段稍细，大小 60 μm～85 μm×8 μm～11 μm，内含 8 个子囊孢子。子囊孢子无色，纺锤形，两端钝圆，多为三个隔膜，大小 18 μm～ 25 μm×3 μm～5 μm（参见附录A）。 人工培养基上一般不产生子囊壳。 6.3 PCR 检测 采用商业化试剂盒或 CTAB 法（参见附录B）提取疑似分离物 DNA，通过 PCR 反应检测。用玉蜀黍 赤霉参照菌株 DNA 作阳性对照，其他真菌 DNA 作阴性对照，无菌水作空白对照。 7 结果判定 若形态特征符合 6.2 中描述，且分离物PCR检测为阳性，即可判定检出玉蜀黍赤霉；否则，判定为 未检出玉蜀黍赤霉。 8 样品保存 8.1 2 样品保存与处理 DB34/T 2814—2017 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出玉蜀黍赤霉的样品应保存于 4℃冰箱中，以备复核。 该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。 8.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为玉蜀黍赤霉的菌株，应妥善保存。将菌株接种 PDA 培养基斜面上， 25℃～28℃ 培养 5 d，然后 4℃冰箱保存，或将菌丝块转入 20％灭菌甘油并混匀，-80℃长期保存。 对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 3 DB34/T 2814—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 玉蜀黍赤霉为害寄主的症状、病菌形态特征图 A.1 4 为害症状 图A.1 玉蜀黍赤霉为害小麦 图A.2 玉蜀黍赤霉为害玉米 DB34/T 2814—2017 A.2 玉蜀黍赤霉形态特征 图中： 1.分生孢子梗及分生孢子； 2.子囊壳； 3.子囊； 4.子囊孢子。 图A.3 玉蜀黍赤霉 5 DB34/T 2814—2017 BB 附 录 B （资料性附录） 玉蜀黍赤霉的 PCR 检测方法 B.1 DNA 提取 B.1.1 CTAB 法提取菌丝 DNA 的方法 B.1.1.1 将样品用液氮碾碎，取 100 mg 至 2 mL EP 管，加入 1000 µL CTAB 裂解液与 10 µL 蛋白 酶K； B.1.1.2 65℃水浴 30 min，每隔 10 min 振荡混匀 1 次，12000 rpm 离心 10 min，将上清液移入 2 mL 新 EP 管中； B.1.1.3 加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，颠倒混匀，12000 rpm 离心 10 min； B.1.1.4 将上清液移入 2 mL 新 EP 管中，加入等体积的异丙醇和 1/10 体积的 3 mol/L NaAc(pH 5. 2)，-20℃ 放置 20 min，12000 rpm 离心 10 min； B.1.1.5 弃上清液，倒置晾干，加入 1 ml 70％乙醇洗涤，12000 rpm 离心 10 min； B.1.1.6 弃上清液，室温倒置于吸水纸上晾干，将 DNA 沉淀溶于 50 µL 无菌水中，-20℃保存备用。 B.1.2 试剂盒提取 DNA 的方法 按试剂盒说明书提取 DNA。 B.2 PCR 反应 B.2.1 PCR 扩增 玉 蜀 黍 赤 霉 特 异 性 引 物 FgF ： 5'- CTGAGAAATATCGCTACACTACCGAC -3' / FgR ： 5'CCCACTCAGGTTGATTTTCGTC-3'，预期扩增产物为 192 bp。 PCR 反应程序为 94℃ 4 min；94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，35 个循环；72℃ 10 min。 B.2.2 PCR 检测 定性 PCR 检测反应体系见表B.1。 表B.1 PCR 扩增玉蜀黍赤霉反应体系 试剂名称 浓度 加样量/µL PCR buffer(含 25 mmol/L MgCL2) 10× 2.5 dNTP 各 2.5 mmol/L 0.5 正义引物 20 µmol/L 1.0 反义引物 20 µmol/L 1.0 TaqDNA 聚合酶 5 U/μL 0.5 DNA 模板 50 ng/µL 1.0 ddH2O 6 补至 25 µL DB34/T 2814—2017 B.2.3 PCR 扩增产物检测 扩增产物用 1.5％琼脂糖凝胶在 1×TAE 缓冲液中电泳，EB 染色后用凝胶成像系统分析。 B.3 结果判定 PCR 扩增产物检测，阳性对照出现一条 192 bp 的 DNA 片段，阴性对照和空白对照没有该核酸条 带，待检样品如出现 192 bp 的 DNA 片段为检测结果阳性，如未出现 192 bp 的 DNA 片段为检测结果 阴性。 _________________________________ 7