ICS  65.020.20 B 16 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3101—2018 猕猴桃溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. actinidae 文稿版次选择 2018 - 04 - 16 发布 安徽省质量技术监督局 2018 - 05 - 16 实施 发 布 DB34/T 3101—2018 前    言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、安徽省检验检疫科学技术 研究院、安徽省农业科学院园艺研究所。 本标准主要起草人：杨雪、陈雨、高同春、戚仁德、姚剑、齐永杰、张金云、伊兴凯、张爱芳、谷春 艳、李云飞、臧昊昱。 I DB34/T 3101—2018 猕猴桃溃疡病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了猕猴桃溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于猕猴桃的苗木、枝叶、花蕾中猕猴桃溃疡病病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 猕猴桃溃疡病菌的基本信息 3.1 病原菌：丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidae） 3.2 分类地位：属细菌界 Bacteria，蛋白菌门 Proteobacteria，变形菌纲 Gamma Proteobacteria， 假单胞目 Pseudomonadales，假单胞科 Pseudomonadaceae，假单胞属 Pseudomonas。其他信息参见附录 A。 4 方法原理 本方法以 PCR 鉴定和致病性鉴定为主要判定依据，猕猴桃溃疡病菌的形态特征作为辅助鉴定依据。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 高速离心机：转速≤15000 r/min 涡旋振荡器 PCR 仪 高压灭菌锅 恒温培养箱：20℃～30℃ 冰箱：4℃、-20℃、-70℃ 恒温水浴锅：4℃～100℃ 电泳仪 凝胶成像仪 可调移液器：1-10μL，10μL-100μL，100μL-1000μL 天平：精度 0.001 g 纯水仪 超净工作台 1 DB34/T 3101—2018 6 试剂和培养基 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682 中三级水的标准。 6.1 PCR 试剂：2×PCR Taq Master Mix 6.2 凝胶电泳试剂：琼脂糖、TAE 电泳缓冲液（参见附录 B.1） 6.3 培养基：细菌培养基（参见附录 B.2） 7 实验室鉴定 7.1 病原菌分离与纯化 将疑似猕猴桃溃疡病的发病组织用 70％乙醇表面消毒后，挑取少许病健交界处的新鲜病组织放到 无菌的培养皿中，加入 0.5 mL 的无菌水，用玻璃棒碾碎后静置 30 min，在细菌培养基上划线培养。 28℃培养 2～3 d 后，挑取乳黄色单菌落用液体细菌培养基摇培，28℃培养 1 d ，-20℃保存备用。 7.2 PCR 鉴定 7.2.1 病原菌 DNA 提取 采用商业化试剂盒提取疑似分离细菌 DNA。 7.2.2 PCR 引物 引物序列为：Psaf1（5’- TTTTGCTTTGCACACCCGATTT -3’）、Psaf2（5’- CACGCACCCTTCAATCAGGATG -3’）。 7.2.3 PCR 体系 反应体系为：2×PCR Taq Master Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 2 μL、DNA 4 μL ，灭菌双蒸水 补足至 50 μL。 7.2.4 PCR 程序 反应程序为：95℃ 2.5 min；94℃ 30 s，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30 个循环；72℃ 8.5 min。 7.2.5 PCR 结果判定 PCR 鉴定用标准猕猴桃溃疡病菌 DNA 作阳性对照，无菌水作阴性对照。 扩增产物用 1.5％琼脂糖凝胶在 1×TAE 缓冲液中电泳，用凝胶成像系统分析。若阳性对照出现一 条 280 bp 的 DNA 片段，阴性对照没有条带，待鉴定菌株能扩增出该 280 bp 的片段，则判定为猕猴 桃溃疡病菌。 7.3 致病性鉴定 根据科赫氏法则，用分离鉴定的猕猴桃溃疡病病原菌接种健康的猕猴桃组织诱导发病，观察发病症 状与田间猕猴桃溃疡病自然发病症状是否一致（参见附录A.2）。 8 结果判定 如 PCR 鉴定结果符合 7.2.5，且致病性鉴定结果符合 7.3，则判定为检出猕猴桃溃疡病菌。 2 DB34/T 3101—2018 9 样品、菌株保存 9.1 样品保存 9.1.1 检疫鉴定后保存样品，以备复验、谈判和仲裁。由鉴定人标识确认、样品管理员登记，置于 -70℃ 冰箱保存。 9.1.2 保存期为一年，有特殊需求保存期可适当延长。 9.1.3 保存期满灭活处理。 9.2 菌株保存 9.2.1 分离并鉴定为猕猴桃溃疡病菌的菌株，应妥善保存。 9.2.2 短期保存可将菌株接种到细菌培养基上，28℃培养 3 d，直接置于 4℃冰箱保存。 9.2.3 长期保存可将菌株接种到液体细菌培养基上，28℃培养 3 d，将菌液与 60％灭菌甘油等体积混 匀，置于 -70℃冰箱保存。 9.2.4 对不需要保存的菌株应及时灭活处理。 3 DB34/T 3101—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 猕猴桃溃疡病菌的基本信息 A.1 猕猴桃溃疡病菌形态特征 猕猴桃溃疡病菌为好气菌，菌体短杆状，革兰氏染色阴性，无荚膜，不产芽孢，鞭毛极生 1～3 根。 见图A.1。 图A.1 A.2 猕猴桃溃疡病菌的培养形态特征 为害症状 猕猴桃溃疡病主要危害猕猴桃的新梢、枝蔓、叶片和花蕾，以危害 1～2 年生枝梢为主，一般不危 害根和果实。感病植株树干或大枝上可出现纵向裂缝。植株受害后，于 2 月中下旬开始发病，最初从 发病部位芽眼、叶痕、皮孔、小伤口等处溢出乳白色粘质菌脓，划破皮层可见韧皮部开始变为深灰色腐 烂。病部皮层组织逐渐变软呈水浸状下陷，在枝蔓上发生 1～3 cm 长的纵裂缝，并流出深绿色水渍状 粘液，高湿条件下，在裂缝处分泌白色菌脓。植株进入伤流期后，病部的菌脓与伤流液混合从伤口漫溢 出，呈锈红色。病斑扩展绕茎一周后导致发病部以上的枝干坏死，也会向下部扩展导致地上部分枯死或 整株死亡。最后流胶部位组织下陷变黑呈铁锈状溃疡斑，病部上端枝条发生龟裂，萎缩枯死。叶片发病 时在新生叶片上呈现褪绿小点，水浸状，后发展为 1～3 mm 的不规则形或多角形褐色病斑，边缘有明 显的淡黄色晕圈，湿度大时病斑湿润并有乳白色菌脓溢出。高温条件下病斑呈红色，在连续阴雨低温条 件下，病斑扩展很快，有时也不产生黄色晕圈。叶片上产生的许多小病斑相互融合形成枯斑，叶片边沿 向上翻卷，不易脱落；秋季叶片病斑呈暗紫色或暗褐色，容易脱落。花蕾受害后不能张开，在开花前变 褐枯死后脱落。受害轻的花蕾虽能开放，但速度较慢或不能完全开放，这样的花可能脱落也可能座果， 但形成的果实较小，易脱落或成为畸形果。花器受害，花冠变褐呈水腐状。 见图A.2。 4 DB34/T 3101—2018 图A.2 A.3 猕猴桃溃疡病发病枝干症状 分布 在我国福建、湖南、四川、陕西、江西、安徽等产区均有发生。 5 DB34/T 3101—2018 BB 附 录 B （资料性附录） 试剂及培养基配方 B.1 TAE 电泳缓冲液(pH 8.5)配方(50 x) Tris 242 g Na2EDTA·2H20 37.5 g 冰乙酸 57.1 mL 蒸馏水 1000 mL 电泳时需用无菌水稀释至 1 x 方可使用。 B.2 细菌培养基：1000 mL 体系 牛肉浸膏 蛋白胨 酵母膏 蔗糖 琼脂粉 NaCl 1 g 5 g 5 g 10 g 20 g 5 g 注：加入水溶解，最后定容至 1000 mL，调 pH 至 6.8-7.0，分装后 121℃高压灭菌 20 分钟。液体细菌培养基则 不加琼脂粉，其他成分、配制条件相同。 _________________________________ 6