ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 3005—2017 猪流行性腹泻病毒分离与 RT-PCR 检测技术 Technology of Isolation and RT-PCR detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus 2017-08-18 发布 山东省质量技术监督局 2017-09-18 实施 发 布 DB37/T 3005—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：吴家强、陈智、陈蕾、赵鹏伟、郭立辉、于江、李俊、杜以军、孙文博、丛晓 燕、时建立、王金宝。 本标准为首次发布。 I DB37/T 3005—2017 猪流行性腹泻病毒分离与 RT-PCR 检测技术 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术的要求。 本标准适用于猪肠道内容物、排泄物或乳汁样品中猪流行性腹泻病毒的分离与检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC水：DEPC（Diethy pyrocarbonate）处理并灭菌后的去离子水。 DMEM：细胞培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）。 PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus）。 双抗：青霉素、链霉素混合液（Penicillin-Streptomycin Solution）。 CPE：致细胞病变效应（cell cytopathic effect）。 4 仪器与试剂 除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》，所用化学试 剂应为分析纯。 4.1 病毒分离需要的仪器与试剂 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 4.1.9 4.1.10 4.1.11 微量可调移液器（最大量程为 10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL）。 20000 g 高速冷冻离心机。 高压灭菌锅。 37 ℃二氧化碳细胞箱。 II 级生物安全柜。 超低温冰箱：可控温至-70 ℃。 PBS。 双抗（100×）（青霉素 10000 IU/mL，链霉素 10000 μg/mL）。 DMEM 培养基。 Vero 细胞。 新生胎牛血清。 1 DB37/T 3005—2017 4.1.12 4.1.13 4.1.14 4.1.15 4.1.16 胰酶。 2 一次性 25 cm 细胞培养瓶。 一次性 10 mL 吸管。 一次性 0.22 μm 滤器。 1.5 mL 离心管。 4.2 RT-PCR 检测需要的仪器与试剂 4.2.1 微量可调移液器（最大量程为 10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL）。 4.2.2 20000 g 高速冷冻离心机。 4.2.3 PCR 仪。 4.2.4 高压灭菌锅。 4.2.5 普通冰箱。 4.2.6 超低温冰箱：可控温至-70 ℃。 4.2.7 PBS。 4.2.8 1.5 mL 离心管。 4.2.9 阳性对照：PEDV CV777 疫苗毒株。 4.2.10 阴性对照：DEPC 水。 4.2.11 引物：采用套式 PCR 进行扩增，设计 2 对引物。PEDV 外 F 5'-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3'，PEDV 外 R 5'-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3' ， PEDV 内 F 5'-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3' ， PEDV 内 R 5'-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3'。 5 方法 5.1 样品采集 5.1.1 活体采样 采集腹泻猪的排泄产物0.5 g～0.7 g或采集乳汁0.5 mL～0.7 mL。 5.1.2 病死猪采样 采集小肠肠道内容物1 g～1.2 g。 5.2 样品处理 将样品按1:4的比例加入PBS，混匀并反复冻融2～3次后，以2000 r/min，4 ℃离心5 min，取上清， 12000 r/min 4 ℃离心15 min，收取上清，过滤除菌置于-70 ℃保存备用。 5.3 病毒分离与鉴定 取24 h生长良好的Vero单层细胞，弃掉培养液，用PBS洗细胞2次，按照每25 cm 培养瓶中加入200 μL 的比例添加处理好的上清，同时加入终浓度为5 μg/mL的胰酶，37 ℃吸附1 h（注意期间每隔20 min轻 摇一次）。之后加入终浓度为5 μg/mL胰酶的维持液（不含血清）。37 ℃培养3 d，其间逐日观察。传 代的细胞培养物反复冻融3次，收取病毒液。用同样的方法盲传3代。每次传代均设不接病毒但含相同胰 酶浓度的对照组细胞。鉴定方法详见5.4。 2 5.4 病毒 RT-PCR 检测技术 2 DB37/T 3005—2017 5.4.1 样品 RNA 的提取 5.4.1.1 取 250 μL 处理后的样品或病毒培养物于 1.5 mL 离心管中，加入 750 μL Trizol 充分混匀， 冰上静置 5 min。 5.4.1.2 加入 200 μL 三氯甲烷，剧烈震荡混匀，冰上放置 5 min 后，以 12000 rpm 4 ℃离心 15 min。 5.4.1.3 吸取 500 μL 上清转移至新 1.5 mL 离心管中，加入等体积异丙醇。-20 ℃放置 20 min，以 12000 rpm 4 ℃离心 15 min。 5.4.1.4 弃去上清，用 1 mL 预冷的 75 %乙醇轻轻冲洗 1.5 mL 离心管，以 12000 rpm 4 ℃离心 5 min。 5.4.1.5 弃去上清，以 7500 rpm 4 ℃离心 5 min，吸取残留液体，在冰盒上静置 5 min～15 min，使 RNA 干燥。 5.4.1.6 加入 20 μL DEPC 水溶解 RNA。立刻进行反转录，剩余 RNA -70 ℃保存。 5.5 第一链 cDNA 合成 5.5.1 反转录反应体系 反转录反应体系，详见附录B.1 5.5.2 反转录反应程序 将配好的反应体系轻轻混匀，如用Oligo(dT)18(0.1 μg/μL)，42 ℃孵育30 min。如用Random Primer(N 9)(0.1 μg/μL)，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min。85 ℃加热5 min灭火反转录酶。 5.5.3 PCR 的条件 取1/10-1/5体积（2 μL～4 μL）的反转录产物为PCR模板。每次PCR均应设立阳性对照与阴性对照 具体参数详见附录B.2。 外PCR反应条件：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30 cycle；72 ℃， 10 min。 进行内PCR反应时，以外PCR产物为模板，进行套式扩增，反应条件与外PCR的反应条件一致。 6 结果判定 6.1 病毒分离检测 阴性对照应无CPE出现；样品接种细胞出现CPE，进一步做RT-PCR检测。 6.2 样品检测 阳性对照有420bp条带出现，阴性对照无420bp条带出现，实验成立。样品出现420bp条带判为阳性， 没有420bp条带判为阴性。 3 DB37/T 3005—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 试剂的配制 A.1 75 %乙醇 无水乙醇 DEPC水 75 mL 25 mL A.2 1 %琼脂糖凝胶 琼脂糖 0.5×TAE缓冲液 0.6 g 60 mL A.3 细胞生长液 含10 %的胎牛血清和1 %双抗的DMEM。 A.4 胰酶 称取10 mg溶于10 mL去离子水中，充分溶解后0.22 μm滤器过滤除菌，分装灭菌的1.5 mL离心管， -20 ℃保存。 A.5 接种病毒后维持液 含1 %双抗的DMEM（不含血清）。 4 DB37/T 3005—2017 BB 附 录 B （规范性附录） RT-PCR 反应体系 B.1 反转录反应体系 表B.1 反转录反应体系 2×TS Reaction Mix 10 μL Random Primer(N19)(0.1 μg/μL) 1.0 μL or Oligo(dT)18(0.1 μg/μL) 1.0 μL 成分 3 EasyScriptTM RT Enzyme Mix 1.0 μL 成分 4 RNA 50 ng～5 μg 成分 5 DEPC 水 补至 20 μL 成分 1 成分 2 B.2 PCR反应体系 表B.2 PCR 反应体系 cDNA 2μL～4 μL Forward Primer (10 μM) 1.0μL～2.0 μL Reverse Primer (10 μM) 1.0μL～2.0 μL 成分 3 2×TransTaq® HiFi PCR Super Mix 25.0 μL 成分 4 DEPC 水 补至 50 μL 成分 1 成分 2 B.3 PCR反应程序 表B.3 PCR 反应程序 步骤 1 步骤 2 步骤 5 温度 时间 95 ℃ 5 min 94 ℃ 30 s 55 ℃ 30 s 72 ℃ 30 s 72 ℃ 10 min 步骤2共运行30个循环。 _________________________________ 5