ICS  65.020 B 16 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2955—2017 瓜蒌叶枯病的病原检测和防治技术规程 Pathogen detection and standardizing control technique of leaf blight disease on Trichosanthes kirilowii Maxim 文稿版次选择 2017 - 09 - 15 发布 安徽省质量技术监督局 2017 - 10 - 15 实施 发 布 DB34/T 2955—2017 前    言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽有余跨越瓜蒌食品开发有限公司、潜山县植保站、凤台县植 保植检站、凤台县农科所。 本标准起草人：张立新、檀根甲、汪章勋、程有余、吴彩铃、徐劲峰、孙友武、胡学友。 I DB34/T 2955—2017 瓜蒌叶枯病的病原检测和防治技术规程 1 范围 本标准规定了瓜蒌叶枯病的病原检测方法和病害防治措施等方面的内容。 本标准适用于瓜蒌叶枯病的诊断和综合防治。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4285 农药安全使用标准 GB/T 8321（所有部分） 农药合理使用准则 NY/T 496 肥料合理使用准则 通则 DB34/T 882 食用栝楼栽培技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 瓜蒌叶枯病 Leaf blight disease on Trichosanthes 由链格孢属的致病性菌株引起瓜蒌叶片枯萎的一种真菌性新病害，其田间症状及发生特点见附录 B.1。 3.2 链格孢病菌 Alternaria alternata 引起该病害的病原为链格孢（Alternaria alternata）。 4 病原检测方法 4.1 保湿培养 采集田间瓜蒌疑似症状病叶，将其置于 95～100％ RH 的高湿环境下 25℃培养 2～3 d，观察病叶 部位是否有霉状物出现，镜检霉状物是否有分生孢子梗及分生孢子，并观察其形态。 4.2 形态学识别 将约 3～5 mm 的病叶组织经 75％乙醇表面消毒、无菌水冲洗后，移到 PDA 培养基平板上 25℃孵 育 3～5 d，可获得真菌分离物。 1 DB34/T 2955—2017 链格孢在 PDA 培养基上菌丝初期灰白色，后期逐渐变为黑褐色。在 PCA 培养基上生长 5～7 天后， 可观察到菌丝中分布有分生孢子梗和大量的分生孢子。 培养基成分及配制方法见附录A，分生孢子梗及分生孢子形态见附录B.2。 4.3 分子鉴定 采用 CTAB 法提取链格孢菌丝体的基因组 DNA, 利用 PCR 方法扩增待检测菌株的核糖体 rDNA 转 录间隔区（ITS1-5.8S-ITS4）、TEF 和 GAPDH 基因，分别获得约 570 bp、280 bp 和 618 bp 的单一 片段。 通过对扩增片段测序，获得待检测菌株的 ITS、TEF 和 GAPDH 基因序列，在 NCBI 网站经 BLAST 同源性搜索后，如与已知链格孢菌株的 ITS、TEF 和 GAPDH 基因序列同源性达到 99～100％，可确定 待检测菌株为链格孢。 ITS、TEF 和 GAPDH 基因的 PCR 扩增引物见附录C。 5 防治措施 5.1 农业防治 选择排水良好的沙壤土种植，加强栽培和肥水管理，施足基肥和有机肥，健壮瓜蒌植株。 重病地应与葫芦科作物进行 3 年以上的轮作，避免相邻田块种植棉花作物等。收获后及时清洁田 园。 参见 NY/T 496 和 DB34/T 882。 5.2 化学防治 5.2.1 防治适期 4月下旬～5月中旬苗期和 6月下旬～7月中上旬幼果生长期为防治适期。 5.2.2 施药方法 发病初期重点防治，发现早期病株，及时将病残体清理出瓜园深埋烧毁外，还要抢晴天喷药防治。 适时用药： ——第一次在 4～5 月份，当病叶率不超过 1％时用药； ——第二次在 6 月下旬～7 月中旬，当病叶率近 3％时用药，间隔 10 d 左右再次用药。 可用 25％的咪鲜胺乳油 2000 倍液、70％代森锰锌可湿性粉剂 1000 倍液、10％苯醚甲环唑水分 散粒剂 1000 倍液或 75％百菌清可湿性粉剂 800 倍液喷雾防治，隔周喷 1 次，轮换用药品种，连喷 2～3 次。 农药使用应符合 GB 4285 和 GB/T 8321 的规定。 2 DB34/T 2955—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 培养基种类和配制流程 表A.1 培养基名称 用途 适宜链格孢菌生长的培养基种类和配制流程 培养基成分 马铃薯 200 g， PDA 分离和培养链 格孢菌 葡萄糖 20 g， 琼脂 20 g， 蒸馏水 1000 mL。 马铃薯100 g， PCA 诱导链格孢菌 胡萝卜 100 g， 产生分生孢子 琼脂 20 g， 蒸馏水 1000 mL。 配制方法 马铃薯去皮后，称取马铃薯 200 g，切成小块，置于容器中， 然后加入蒸馏水 1000 mL，加热煮沸 20 min，经双层纱布过 滤后补足蒸馏水，再依次加入葡萄糖 20 g，待其溶解后，再 加入琼脂 20 g 煮溶并补足蒸馏水，最后分装于 250 mL 三 角瓶中灭菌即可。 马铃薯去皮后，称取马铃薯和胡萝卜各 100 g，然后将马铃 薯和胡萝卜切成小块，置于容器中，并加入蒸馏水 1000 mL， 加热煮沸 20 min，经双层纱布过滤后补足蒸馏水，再加入琼 脂煮溶并补足蒸馏水，最后分装于 250 mL 三角瓶中灭菌即 可。 3 DB34/T 2955—2017 BB 附 录 B （资料性附录） 瓜蒌叶枯病的症状及其病原形态 B.1 瓜蒌叶枯病的田间症状及发生特点 初期植株下部叶片边缘出现典型黄褐色坏死斑，且周围环绕黄色晕圈，随着时间的延长，病斑逐渐 向叶片基部扩展延伸，病斑相互结合成大面积坏死斑，最终叶片枯死脱落。 该病在瓜蒌苗期、成株期均可发生，主要危害瓜蒌叶片。 病害通常从植株下部叶片开始发病，然后向上部叶片扩展。外部气候条件适宜时，感病植株叶片迅 速出现萎蔫，随后叶片变黄脱落。 田间病叶、病残体是引起大田发病的主要初侵染来源。（见图B.1） 图B.1 B.2 瓜蒌叶枯病的田间症状 链格孢的分生孢子梗及分生孢子形态 分生孢子梗单生或成簇，黄褐色，合轴式延伸。分生孢子倒棍棒状，黄褐色，多细胞，有横隔和纵 隔，单个着生或成链状。（见图B.2） 4 DB34/T 2955—2017 图B.2 链格孢的分生孢子梗及分生孢子形态 5 DB34/T 2955—2017 CC 附 录 C （资料性附录） 瓜蒌叶枯病菌目的片段的扩增引物 表C.1 PCR 扩增目的片段及引物序列 目的片段 ITS TEF GAPDH 引物 引物序列 扩增片段长度 （5’-3’） (bp) ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC EF1F CATCGAGAAGTTCGAGAAGG EF1R TACTTGAAGGAACCCTTACC GPD1 CAACGGCTTCGGTCGCATTG GPD2 GCCAAGCAGTTGGTTGTG _________________________________ 6 570 280 618