ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1611—2019 细叶百合组织培养技术规程 Technical regulation of tissue culture of lilium pumilum 2019-03-15 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-06-15 实施 发 布 DB15/T 1611—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司提出。 本标准由内蒙古自治区草原生态修复标准化技术委员会（SAM/TC34）归口。 本标准起草单位：内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司。 本标准主要起草人：高秀梅、田志来、马怀林、张永清、李晶晶、白俊梅、崔海鹏、刘思泱。 I DB15/T 1611—2019 细叶百合组织培养技术规程 1 范围 本标准规定了细叶百合组织的相关术语和定义、实验室设施与要求、培养基制备和组织培养过程。 本标准适用于细叶百合规模化组培育苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603-2002 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细叶百合 lilium pumilum 细叶百合别名山丹、卷莲花，为多年生百合科草本植物。 3.2 结球培养 bulb-inducted 将增殖的丛生芽接种到结球培养基中促进鳞茎形成的过程。 4 实验室设施与要求 试验室设计与设施按照NY/T 2036-2013，4.1.3执行。 5 培养基的制备 5.1 培养基的配制 MS培养基母液的配制顺序及比例参见附录A，配制使用蒸馏水。大量元素按照比使用浓度高10～100 倍进行配制，微量元素按照比使用浓度高20～1000倍进行配制，作为贮备液。 5.2 植物生长调节剂母液的配制 1 DB15/T 1611—2019 5.2.1 配制 植物生长调节剂母液的配制浓度为6-BA 0.2 mg/L～2.0 mg/L，NAA 0.1 mg/L～0.5 mg/L。 5.2.2 储存 配制好的母液贴上标签，注明名称和日期，保存于4 ℃冰箱中，尽快使用。 5.2.3 其他物质 用3.5 g/L卡拉胶作固化剂，3 %的食用白糖代替蔗糖作为碳源。 5.3 培养基的制作 5.3.1 母液配制 按照附录A依次取MS母液，大量元素50 ml/L、微量元素5 ml/L、铁盐5 ml/L、有机成分5 ml/L，根 据生长要求加入植物生长调节剂（不耐高温的药品，应在培养基灭菌后再过滤灭菌加入），加入3.5 g/L 卡拉胶、3 %的食用白糖，贴上标签，注明名称和日期，保存于4 ℃冰箱中，尽快使用。 5.3.2 定容 取出母液，用玻璃棒搅拌混匀，加入沸腾的自来水并不断搅拌使卡拉胶和糖溶解，加水至容器刻度 （1 L或10 L）。 5.3.3 pH 值调试 定容后调试pH值，用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液，调pH为5.8～6.0。配制溶液方法按照GB/T 603 执行。 5.3.4 分装 将调好的培养基根据不同需求进行分装，增殖培养基规格为容量300 ml的培养瓶，每瓶分装60 ml～ 70 ml；生根培养基，每瓶分装40 ml～50 ml。 5.3.5 封口 培养瓶用封口膜或者瓶盖封口，用绳子扎紧或者拧紧。 5.3.6 灭菌 将捆绑好的培养瓶尽快进行高压灭菌，121 ℃灭菌20 min～25 min。 5.3.7 储存 灭菌后的培养基标明编号及日期，冷却和凝固后放置观察2 d～3 d，按灭菌先后顺序使用，且存储 时间不超出一个月。 6 组织培养过程 6.1 外植体的选取及灭菌 2 DB15/T 1611—2019 6.1.1 外植体选取 在春季将要出芽或者刚出芽时，取其中层鳞片。 6.1.2 外植体灭菌 外植体灭菌流程为: a) 鳞片稍加冲洗去掉泥土； b) 在超净台放入无菌容器中； c) 在每升滴加 2～3 滴“Tween-20”的洗涤剂溶液中浸泡 60 s； d) 转入 75 %的酒精中浸泡 30 s； e) 再用 0.15 %的升汞溶液处理 20 min； f) 无菌水淋洗 3～4 次； g) 无菌滤纸上吸干水分，直接接入预先配制好的培养基中。 6.2 培养条件 培养温度为：25 ℃±1 ℃，光照强度2500 Lx，除自然光照外，夜间补光4 h/d。 6.3 初代培养 将中层鳞片接入到培养基MS+6-BA 0.5 mg/L～2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L～0.5 mg/L +VC 5 mg/L中。 6.4 继代培养 将诱导分化出的1 cm～3 cm不定芽切成单株，接种到增殖培养基MS+6-BA 0.2 mg/L～2.0 mg/L +NAA 0.01 mg/L～0.3 mg/L ，约10 d后底部开始愈伤化，约45 d后可继续继代增殖培养。 6.5 结球培养 将增殖的丛生芽接种于1/2MS+IBA 0.5 mg/L+2%食用白糖的结球培养基中，诱导鳞茎形成，促进结 球。 6.6 生根培养 将长3 cm～4 cm的组培苗，分成单株接种于1/2MS+IBA 0.5 mg/L生根培养基上,培养15 d～20 d后 移栽。 6.7 炼苗 将生长健壮、根长到1 cm～2 cm的组培苗进行炼苗，前2 d闭瓶炼苗，而后2 d～3 d开瓶炼苗。 6.8 移栽 将培养苗从培养瓶中倒出，清水洗净根部残留的培养基，用50 ppm的IBA沾根8 min后，栽入栽培基 质中，基质成分为蛭石+羊粪+磷酸二铵。当组培苗长至3～4片真叶后，可移入假植圃假植或直接定植， 在此期可适量施稀释的复合肥。 3 DB15/T 1611—2019 AA 附 录 A （资料性附录） MS 培养基成分表 表A.1 MS 培养基成分表 成分 MS 贮备液配制浓度 每升培养基取用量 mg/L ml 大量元素 NH4NO3 33000 KNO3 38000 CaCl2H2O 8800 MgSO47H2O 7400 KH2PO4 3400 50 微量元素 KI 166 H3BO3 1240 MnSO44H2O 4460 ZnSO47H2O 1720 Na2MoO42H2O 50 CuSO45H2O 5 CoCl26H2O 5 5 铁盐 FeSO47H2O 5560 Na2EDTA2H2O 7460 5 有机成分 肌醇 20000 烟酸 100 盐酸吡哆醇 100 烟酸硫胺素 20 甘氨酸 400 _________________________________ 4 5