ICS 07.100.10 C 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 243—2019 代替 DB 22/T 243-2000 霍乱弧菌检测 气相色谱-质谱法 Method of Vibrio cholera With Gas chromatography-mass spectrometry 2019 - 10 - 14 发布 吉林省市场监督管理厅 2019 - 11 - 01 实施 发 布 DB22/T 243—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 和GB/T 20001.4-2015给出的规则修订。 本标准代替 DB22/T 243-2000《气相色谱-质谱检测霍乱弧菌的方法》。与 DB22/T 243-2000 相比， 除编辑性修改外主要技术变化如下： ――修改标准名称为《霍乱弧菌检测 气相色谱-质谱法》； ――在“规范性引用文件”中，增加了GB/T 6682和 GB 19489（见2）；删除了GB 15984-1995 ； ――增加了“原理”（见3）； ――修改了“试剂和材料”（见4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6，2000年版的 3）； ――增加了“标准菌株”（见4.11）； ――增加了“材料”（见4.17）； ――增加了“恒温培养箱”（见5.9）； ――增加了“Ⅱ级生物安全柜”（见5.10）； ――增加了“样品分离培养方法”（见 6.1）； ――修改了“色谱条件”（见 7.3.1，2000 年版的 4.1）； ――修改了“进样方式”（见 7.3.1.6，2000 年版的 5.3）； ――增加了“质量保证”（见 9）； ――增加了“废弃物的处理”（见 10）； ――增加了“试验报告”（见 11）。 本标准由吉林省卫生健康委员会提出并归口。 本标准修订单位：吉林省疾病预防控制中心。 本标准主要修订人：杨修军、张炜煜、崔勇、张立夫、姚佳彤。 本标准的历次版本发布情况为： ——DB22/T 243-2000。 I DB22/T 243—2019 霍乱弧菌检测 气相色谱-质谱法 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问 题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了霍乱弧菌气相色谱-质谱检验方法。 本标准适用于病例样本和环境样本中霍乱弧菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 原理 气相色谱是一种以气体为流动相，采用冲洗法的柱色谱分离技术，并与适当的鉴定手段相结合的一 种分析方法。不同菌属或同属不同血清型细菌全细胞脂肪酸组成成分不同，它们有各自不同的色谱-质 谱指纹图，根据峰值不同进行判断。根据霍乱弧菌种共有特异性峰值判断可检出羟基十四烷酸甲酯 （C15H30O3）、油酸甲酯（C18H34O2）、亚油酸甲酯（C18H32O2）和异硬酯酸甲酯（C19H38O2）。霍乱 弧菌埃尔托生物型稻叶血清型菌株细胞脂肪酸---十六烯酸甲酯（C17H32O2）进行霍乱弧菌埃尔托生物 型稻叶血清型和埃尔托生物型小川血清型区别。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验室用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 氢氧化钾：色谱纯。 4.3 正庚烷：色谱纯。 4.4 氯化钠：色谱纯。 4.5 无水硫酸钠：色谱纯。 4.6 石油醚：色谱纯（60 ℃～90 ℃）。 4.7 甲醇-甲苯-硫酸溶液（30+15+1） 4.8 三氟化硼-甲醇溶液（15+85）。 4.9 氦气。 4.10 生理盐水。 1 DB22/T 243—2019 4.11 标准菌株: a) 埃尔托生物型小川血清型 CMCC18514； b) 埃尔托生物型稻叶血清型 CMCC18512。 4.12 庆大霉素琼脂培养基。 4.13 碱性蛋白胨水。 4.14 TCBS 培养基。 4.15 大豆胰酶解酪蛋白肉汤培养基。 4.16 氮气 4.17 材料： a) 有机滤膜(碳酸氢钠)，0.22 μm； b) 毛细柱(中等极性)，30 m×0.25 mm×0.25 μm； c) 皂化瓶：50 mL； d) 离心管：10 mL； e) 离心管：1.5 mL； f) 玻璃安瓶。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 6 气相色谱-串联质谱仪：EI 源。 电子分析天平：感量 0.1 mg。 离心机：最低转速不低于 12000 r/min。 氮吹仪。 涡旋混合器。 恒温水浴箱。 真空冷冻干燥机。 麦氏比浊仪。 恒温培养箱（36 ℃±1 ℃）。 Ⅱ级生物安全柜。 微量可调移液器及配套带滤芯吸头（100 μL）。 样品 6.1 样品分离培养 将样本（5.10）及标准菌株（4.11 a和4.11 b）接种到碱性蛋白胨水（4.13）36 ℃±1 ℃增菌培 养（5.9）6 h～8 h后，从菌膜下表层取 1 接种环接种于庆大霉素培养基（4.12）上36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h；必要时进行 2 次增菌培养。从分离培养基上挑取疑似菌落接种于TCBS培养基（4.14）进 行纯培养，36 ℃±1 ℃，18 h～24 h。用生理盐水(4.10)制备1麦氏单位（5.8）菌悬液10 mL，80 ℃， 30 min（5.6）灭活。从灭活菌悬液中吸取（5.11）100 uL无菌菌液接种到大豆胰酶解酪蛋白肉汤培养 基（4.15）中，37 ℃培养18 h～24 h，无菌生长。 6.2 冻干菌粉的制备 将灭活后菌悬液离心（5.3）12000 r/min,5 min，弃上清取沉淀，真空冷冻干燥（5.7）。 2 DB22/T 243—2019 7 试验步骤 7.1 酸甲酯化 将冻干灭活菌粉5 mg放入玻璃安瓶（4.17 f）中，加入1 mL甲醇一甲苯—硫酸(30+15+1)(4.7)混 匀，熔封安瓶。在80 ℃水浴(5.6)水解酯化18 h，冷却后加入2 mL石油醚(4.6)离心，取上层提取液通 过碳酸氢钠过滤器(4.17 a)过滤，滤液用氮气(5.4)吹干后，加0.5 mL的正庚烷(4.3)溶解。 7.2 碱甲酯化 取冻干灭活菌粉5 mg于皂化瓶（4.17.c）中加4 mL 0.5 mol/L 氢氧化钾（4.2）-甲醇（4.1）溶 液，皂化瓶中连接冷凝管，并向瓶中通入氮气（4.16），在60 ℃水浴上反应20 min冷却后，从冷凝管 的上口加入4 mL三氟化硼一甲醇溶液(4.8)反应2 min，取下皂化瓶加入2 mL正庚烷(4.3)混合1 min，先 加入少量的饱和氯化钠(4.4)水溶液，混匀后，再加大量的饱和氯化钠水溶液液至瓶口，将上清液用无 水硫酸钠(4.5)脱水后，移入1.5 mL离心管(4.17 e)中，用氮气吹至0.5 mL。 7.3 仪器参考操作条件 7.3.1 色谱条件 7.3.1.1 7.3.1.2 7.3.1.3 7.3.1.4 7.3.1.5 7.3.1.6 7.3.2 色谱柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm。 柱温：80 ℃。以 10 ℃升温 250 ℃并保持 10 min。 进样口温度 230 ℃，检测温度 250 ℃，柱流量 2 mL/min；分流比 5:1。 色谱质谱接口温度 280 ℃，载气为氦气（4.4），流量为 1.0 mL/min。 进样量为 1.0 μL。 进样方式 ：为无分流进样，1 min 后开阀。 质谱条件 7.3.2.1 电离方式 电子轰击源（EI）；电离能量70 eV。 7.3.2.2 离子监测方式 全扫描方式。 8 8.1 试验数据处理 结果判定 8.1.1 检出羟基十四烷酸甲酯（C15H30O3）、油酸甲酯（C18H34O2）、亚油酸甲酯（C18H32O2）和异硬酯酸甲 酯（C19H38O2）特异性峰，判定为“霍乱弧菌”。 8.1.2 检出十六烯酸甲酯（C17H32O2）特异性峰，判定为霍乱弧菌埃尔托生物型稻叶血清型，而非霍乱 弧菌埃尔托生物型小川血清型。 9 9.1 质量保证 空白对照 3 DB22/T 243—2019 用生理盐水做实验空白。 9.2 阳性对照 9.2.1 9.2.2 10 埃尔托生物型稻叶血清型 CMCC18514，参见附录 A 图 A.1。 埃尔托生物型小川血清型 CMCC18512，参见附录 A 图 A.2。 废弃物处理 按GB 19489规定执行。 11 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面内容： a) 试验对象； b) 所使用的标准（包括发布或出版年号）； c) 所使用的方法（如果标准中包括几个方法）； d) 结果； e) 观察到的异常现象； f) 试验日期。 4 DB22/T 243—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 霍乱弧菌标准菌株细胞脂肪酸酸气相质谱指纹图谱 2 种霍乱弧菌标准菌株细胞脂肪酸酸气相质谱指纹图谱见图A.1 和图A.2。 图A.1 图A.2 _________________________________ 5