ICS  65.020.20 B 16 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2813—2017 梨炭疽病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Colletotrichum gloeosporioides Penz． 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 安徽省质量技术监督局 2017 - 04 - 30 实施 发 布 DB34/T 2813—2017 前    言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院、安徽省农科院植物保护与农产品质量安全 研究所。 本标准主要起草人：李云飞、陈雪娇、宗凯、杨雪、孙娟娟、郑海松、姚剑、陈雨、余晓峰、王满 满。 I DB34/T 2813—2017 梨炭疽病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了梨炭疽病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于果实、苗木及其制品中梨炭疽病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 梨炭疽病菌基本信息 学名：Colletotrichum gloeosporioides Penz. 分类地位：真菌界（Fungi），黑盘孢目（Melanconiales）,黑盘孢科（Melanconiaceae），炭疽 菌属（Colletotrichum），其有性阶段为围小丛壳（Glomerella cingulata）。 传播途径：梨炭疽病主要借助雨水、昆虫等进行近距离传播，借助果实、苗木及其制品等的调运进 行远距离传播。 4 方法原理 根据梨炭疽病菌在寄主上的为害症状（参见附录A），培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分 生孢子器等形态特征，以及 PCR 特异扩增片段大小进行结果判定。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR 仪、凝 胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。 5.2 主要试剂 5.2.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682 的规定。 5.2.2 1％次氯酸钠。 5.2.3 DNA 提取试剂：DNA 提取试剂盒， CTAB 裂解液（20 g/L CTAB，0.1 mol/L Tris，1.4 mol/L Nacl， 20 mmol/L EDTA-Na2），蛋白酶 K（20 mg/mL），苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，3 mol/L NaAc(pH 5.2)，异丙醇，70％乙醇，无菌水。 5.2.4 PCR 试剂：10×PCR buffer（含 25 mmol/L MgCl2），Taq 酶，dNTP。 1 DB34/T 2813—2017 5.2.5 凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，Loading Buffer，EB。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，氯霉素 0.1 g，琼脂 13.0 g，蒸馏水定容至 1000 mL，调整 pH 值至 6.7 ，121℃高压灭菌 15 min。 6 病菌的鉴定 6.1 分离培养 挑取具有疑似症状的果实或植物组织，用解剖刀取植株病健交界处的组织，剪成约 0.4 cm×0.4 cm 小段，用 1％的次氯酸钠溶液消毒 60 s，无菌水洗涤 3 次，灭菌滤纸吸干水分后置于 PDA 培养基上， 在 25℃～30℃，12 h 黑暗/12 h 光照（12 h 光暗交替）条件下培养，第 3 d 开始观察，根据组织周 围新生菌落的形态进行选取，取边缘菌丝转接纯化。 6.2 鉴定特征 PDA 培养基上，菌落圆形，绒毛状，气生菌丝生长较密集；菌落初期白色，后期四周呈灰白色，中 心逐渐转为灰黑色至墨绿色，背面可见粉红色分生孢子团，偶尔可见黑色圆点散布其中。分生孢子盘圆 形或近圆形，黑褐色，突起于培养基表面；分生孢子梗无色、圆柱形或棒状，其上着生单个孢子；分生 孢子圆柱形、单孢、无色，大小为 10 μm～35 μm×3.7 μm～7.0 μm，中间有一油滴，参见附录B。子囊 壳暗褐色，烧瓶状，直径为 85 μm～300 μm；子囊长棍棒形，平行排列于子囊壳内，大小为 55 μm～ 70 μm×9 μm，内含 8 个子囊孢子；子囊孢子单胞无色，卵圆形或长椭圆形，稍弯曲，12 μm～22 μm×3.7 μm～5.0 μm。 6.3 PCR 检测 采用商业化试剂盒或 CTAB 法（参见附录C）提取疑似分离物 DNA，通过 PCR 反应检测。用梨炭疽 病菌 DNA 作阳性对照，其他真菌 DNA 作阴性对照，无菌水作空白对照。 7 结果判定 若形态特征符合 6.2 中描述，且分离物PCR检测为阳性，即可判定检出梨炭疽病菌；否则，判定为 未检出梨炭疽病菌。 8 样品保存 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨炭疽病菌的样品应保存于 4℃冰箱中，以备复核。 该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。 8.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为梨炭疽病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种 PDA 培养基斜面上， 25℃～30℃ 培养 5 d，然后 4℃冰箱保存，或将菌丝块转入 20％灭菌甘油并混匀，-80℃长期保存。 对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 2 DB34/T 2813—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 梨炭疽病菌为害果实及植株的症状 A.1 梨炭疽病菌为害果实的症状 果实染病后，初果面现浅褐色水浸状小圆斑，后病斑渐扩大，色泽变深，并软腐下凹，病斑表面颜 色深浅交替，具明显同心轮纹。在病部表皮下形成很多小粒点，稍隆起，初褐色，后变黑色，即病原菌 分生孢子盘，分生孢子盘多排列成轮纹状，在温暖湿度大条件下，孢子盘突破表皮涌出粉红色粘质物， 即病菌分生孢子团块。病斑扩展致烂入果肉或直达果心，果实变褐有苦味，果实受害常呈圆锥形向果心 深入，致整个果实腐烂或干缩为僵果。 A.2 梨炭疽病菌为害植株的症状 枝梢染病多发生在枯枝或生长衰弱的枝条上，初仅形成深褐色小型圆斑，后扩展为长条形或椭圆形， 病斑中部凹陷或干缩，致皮层、木质部呈深褐色或枯死。叶片上发病，多在叶正面产生病症，叶片上数 个病斑可连片成不规则的黑褐色大斑使叶片焦枯，有时可见明显的轮纹，病斑可发生在叶脉间、叶脉上、 叶缘、叶尖、叶柄上，叶背面病斑对应处为较光滑的褐色斑，发病的叶片过早脱落。 3 DB34/T 2813—2017 BB 附 录 B （资料性附录） 梨炭疽病菌为害果实的症状、病菌形态特征图 B.1 为害症状 见图B.1。 图B.1 B.2 果实被害状 病菌形态特征 见图B.2。 图中： 1.分生孢子盘剖面 2.分生孢子梗 3.分生孢子 4.子囊壳剖面 5.子囊 6.子囊孢子 图B.2 4 梨炭疽病菌 DB34/T 2813—2017 CC 附 录 C （资料性附录） 梨炭疽病病菌的 PCR 检测 C.1 DNA 提取 C.1.1 CTAB 法提取菌丝 DNA 的方法 C.1.1.1 样品用液氮碾碎，取 100 mg 至 2 mL EP 管，加入 1000 µL CTAB 裂解液与 10 µL 蛋白酶 K； C.1.1.2 65℃水浴 30 min，每隔 10 min 振荡混匀 1 次，12000 rpm 离心 10 min，将上清液移入 2 mL 新 EP 管中； C.1.1.3 加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，颠倒混匀，12000 rpm 离心 10 min； C.1.1.4 将上清液移入 2 mL 新 EP 管中，加入等体积的异丙醇和 1/10 体积的 3 mol/L NaAc(pH 5. 2)，-20℃ 放置 20 min，12000 rpm 离心 10 min； C.1.1.5 弃上清液，倒置晾干，加入 1 ml 70％乙醇洗涤，12000 rpm 离心 10 min； C.1.1.6 弃上清液，室温倒置于吸水纸上晾干，将 DNA 沉淀溶于 50 µL 无菌水中，-20℃保存备用。 C.1.2 试剂盒提取 DNA 的方法 按试剂盒说明书提取 DNA。 C.2 C.2.1 PCR反应 PCR扩增 梨炭疽病菌C. gloeosporioides 特异性引物对 CgF：5'- GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGG -3' / CgR：5'ACCTTTGAGGGCCTACATCAG -3'，预期扩增产物为 329bp。PCR 反应程序为 94℃ 5 min； 94℃ 1 min， 63℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 7 min。 PCR 扩增反应体系见表C.1。 表C.1 PCR 扩增梨炭疽病菌反应体系 加样量 试剂名称 浓度 PCR buffer(含 25 mmol/L MgCl2) 10× 2.5 dNTP 各 2.5 mmol/L 0.5 正义引物 20 µmol/L 1.0 反义引物 20 µmol/L 1.0 TaqDNA 聚合酶 5 U/μL 0.5 DNA 模板 50 ng/µL 1.0 ddH2O /µL 补至 25 µL 5 DB34/T 2813—2017 C.2.2 PCR扩增产物检测 扩增产物用 1.5％琼脂糖凝胶在 1×TAE 缓冲液中电泳，EB 染色后用凝胶成像系统分析。 C.3 结果判定 PCR 扩增产物检测，阳性对照出现一条 329bp 的 DNA 片段，阴性对照和空白对照没有该核酸条带， 待检样品如出现 329bp 的 DNA 片段为检测结果阳性，如未出现 329bp 的 DNA 片段为检测结果阴性。 _________________________________ 6