ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 2995—2017 副猪嗜血杆菌荧光定量 PCR 检测技术 Technology of Real-time PCR Assay In Haemophilus parasuis 2017-08-18 发布 山东省质量技术监督局 2017-09-18 实施 发 布 DB37/T 2995—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：吴家强、于江、郭立辉、张玉玉、杜以军、李俊、陈蕾、陈智、孙文博、丛晓 燕、时建立、王金宝。 本标准为首次发布。 I DB37/T 2995—2017 副猪嗜血杆菌荧光定量 PCR 检测技术 1 范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的要求。 本标准适用于猪血液、组织及细菌培养物中副猪嗜血杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Ct值 Cycle threshold 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 HPS：副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis） 5 仪器与试剂 除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682的要求。 5.1 微量可调移液器（最大量程为 10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL）。 5.2 高速冷冻离心机。 5.3 荧光定量 PCR 仪。 5.4 水浴锅。 5.5 恒温培养箱。 5.6 -20 ℃冰箱。 5.7 二级生物安全柜。 5.8 超低温冰箱：可控温至-70 ℃。 5.9 10 mL 抗凝采血管。 5.10 一次性无菌 5 mL 注射器。 1 DB37/T 2995—2017 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 1.5 mL 无 RNA 酶离心管。 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管。 PBS 缓冲液。 SYBR Green Ⅰ核酸染料（含酶）。 蛋白酶 K（见附录 A.1）。 10%SDS 液（见附录 A.2）。 70%乙醇（见附录 A.3）。 引物：P1：5'-ACCAGAAGCAAACCCAGAGC-3'，P2：5'-ACACCGCTTGCCATACCCTC-3'。 标准阳性对照：HPS infB 基因阳性质粒。 标准阴性对照：无菌超纯水。 6 方法 6.1 样品采集 6.1.1 活体采样：无菌采集抗凝血。 6.1.2 病死猪采样：无菌采集心包积液或胸腔积液或肺脏组织。 6.1.3 细菌培养物：37 ℃培养 24 h～48 h 的细菌培养物。 6.2 样品处理 6.2.1 组织样品处理：取肺脏组织 3 g～5 g 于研钵中，用灭菌剪刀剪碎，加入 2 mL PBS 缓冲液，研 磨。 6.2.2 细菌培养物处理：挑取 3～4 个细菌单菌落加入 100 μL 灭菌水中，煮沸 10 min 后，再放置-20 ℃ 冻结。冻融后，10000 r/min 离心 5 min，取上清作为 DNA 模板，-20 ℃保存备用。 6.3 核酸提取 6.3.1 取样品 500 μL 于 1.5 mL 离心管中，加入 50 μg/mL 的蛋白酶 K 5 μL，加入 10 %的 SDS 溶液 25 μL，55 ℃水浴 2 h～3 h。 6.3.2 加入 200 μL Tris 饱和酚，充分混匀，10000 r/min 离心 15 min。 6.3.3 取上清于一新的离心管中，加入 200 μL Tris 饱和酚和 200 μL 氯仿，10000 r/min 离心 15 min。 6.3.4 取上清于一新离心管中，加入 200 μL 氯仿，10000 r/min 离心 15 min。 6.3.5 取上清于一新离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20 ℃静止 20 min，10000 r/min 离心 15 min，弃上清。 6.3.6 加入 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 6.3.7 加入 100 μL 灭菌超纯水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。 6.4 荧光定量 PCR 反应体系 荧光定量PCR反应体系，详见附录B.1。 6.5 荧光定量 PCR 程序设定 每次PCR均应设阳性对照与阴性对照，具体参数见附录B.2。 7 结果判定 2 DB37/T 2995—2017 7.1 试验成立条件 7.1.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 7.1.2 阳性对照 Ct 值＜30，并出现特定扩增曲线，否则，此试验视为无效。 7.2 判定 7.2.1 阴性 Ct值＞35，表明样品为阴性。 7.2.2 阳性 Ct值＜30，且出现特定扩增曲线，表明样品中存在HPS。 7.2.3 疑似 30≤Ct值≤35的样品须重检，结果仍然在该区间，判定为阳性。 3 DB37/T 2995—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 试剂的配制 A.1 蛋白酶K溶液(20 mg/mL) 蛋白酶K 灭菌双蒸水 100 mg 5 mL A.2 10 %十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2） 十二烷基硫酸钠 灭菌双蒸水 浓盐酸 灭菌双蒸水 10 g 80 mL 调pH至7.2 加至100 mL A.3 70 %乙醇 无水乙醇 灭菌双蒸水 70 mL 30 mL 4 DB37/T 2995—2017 BB 附 录 B （规范性附录） 荧光定量 PCR 反应体系和程序 B.1 荧光定量PCR反应体系 表B.1 荧光定量 PCR 反应体系 组分 反应体系 SYBR Green Ⅰ核酸染料 12.5 μL 引物 P1 1.0 μL 引物 P2 1.0 μL DNA 模板 2.0 μL 灭菌水 8.5 μL 总量 25.0 μL B.2 荧光定量PCR反应程序 表B.2 荧光定量 PCR 反应程序设定 温度 时间 步骤 1 95 ℃ 10 min 步骤 2（40 个循环） 95 ℃ 10 s 58 ℃收集信号 10 s 95 ℃ 2 min 60 ℃ 20 s 95 ℃ Continue 步骤 3 _________________________________ 5