ICS 65.020.30 B 40 云 南 省 地 方 标 准 DB53/T 939—2019 家畜体细胞系建立与冷冻保存 2019 - 09 - 23 发布 云南省市场监督管理局 2019 - 12 - 23 实施 发 布 DB53/T 939—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由云南省农业厅提出。 本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。 本标准起草单位：云南省畜牧兽医科学院。 本标准主要起草人：洪琼花、吕春荣、权国波、邵庆勇、吴国权、欧阳依娜、杨红远。 I DB53/T 939—2019 家畜体细胞系建立与冷冻保存 1 范围 本规程规定了家畜体细胞系建立、冷冻保存方法、细胞系命名。 本规程适用于猪、牛、羊、马等家畜体细胞系建立、冷冻保存与细胞系命名。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 原代培养 是指直接从家畜组织或器官，将其分散成细胞后开始的培养。 2.2 细胞系 指原代细胞培养物经首次传代成功后所增殖的细胞群体，可泛指一般可能连续传代的细胞。 3 工作区条件 洁净环境下，无菌操作。 4 体细胞系的建立 4.1 试剂 无钙、镁的磷酸缓冲盐溶液，含有4.00mM L-谷氨酰胺，4500 mg/L葡萄糖的高糖DMEM，胎牛血清， 1%双抗，蛋白酶－乙二胺四乙酸：0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA），二甲基亚砜（DMSO）。 4.2 培养液 高糖DMEM，10%～15%胎牛血清，1%双抗。 4.3 样品采集、保存与运输 4.3.1 采样个体选择 选取系谱清楚、生长发育良好、健康无病的青幼年个体。 4.3.2 采集耳缘组织样本 采集耳缘组织按以下步骤进行： 1 DB53/T 939—2019 a) b) c) d) 4.3.3 先刮净采样部位耳毛，再用碘酒、75%的酒精消毒。 用消毒过的采样工具采取样品。 样品放入 5 mL～10 mL 备有培养基的离心管中，并封口。 标记样品名称、性别、年龄、采样地点、采样部位、个体编号及采样时间等信息，记录表参见 附录 A 中表 A.1。 样品保存与运输 样品放入4 ℃的采样箱后应于48 h内带回实验室进行原代培养。 4.4 细胞培养 4.4.1 培养条件 在5% CO2、饱和湿度、37.0 ℃培养箱中进行培养。培养液变黄时应更换培养液，再继续培养。 4.4.2 原代培养 原代培养按以下步骤进行： a) 无菌耳缘组织在 75%的酒精中浸泡 1 min～2 min，用含 1%双抗的 PBS 反复洗涤 3 次，每次 5 min。 3 b) 用眼科剪剪成 1 mm 左右的碎块，置于培养瓶（皿）中进行组织块贴壁培养。 c) 用消毒过的采样工具采取样品。 d) 组织贴壁稳定后，加入培养液继续培养。 4.4.3 传代培养 传代培养按以下步骤进行： a) 待细胞增殖至培养瓶（皿）底壁的 80%～85%时，弃除培养液，添加细胞消化液在 37.0 ℃消化 3 min～5 min。 b) 显微镜观察，成纤维细胞由梭形变为圆形时立即添加培养液终止消化，制成细胞悬液。 c) 将细胞悬液移至离心管中，经 1 000 g/min 离心 5 min 后弃上清，加入 PBS 于相同条件下离 心清洗后，用培养液重悬细胞，用血球计数板或细胞计数仪计数细胞，调整细胞密度在 1.0× 105 个/mL 对细胞进行传代培养。 5 冷冻保存 5.1 冷冻保存液 高糖DMEM，10%二甲基亚砜（DMSO），20%～30%胎牛血清。 5.2 细胞冷冻保存 原代细胞和传代细胞均可用于冷冻保存，冷冻保存按以下步骤进行： a) 将培养细胞制成单细胞悬液，并计数，使其密度在 1.0×106 个/mL～3.0×106 个/mL。 b) 按 1 mL/每管分装在冻存管中，标明细胞名称、冻存管编号、性别、冻存日期、代次。 c) 投入液氮（-196 ℃）保存，并做好相应记录，记录表参见附录 A 中表 A.2。 5.3 细胞复苏 细胞复苏按以下步骤进行： 2 DB53/T 939—2019 a) 从液氮中取出细胞冻存管，放入 40 ℃水浴中不断摇动 1 min 取出，用 70%酒精消毒冻存管。 b) 吸出细胞悬液，放入离心管中，加入 10 倍体积的细胞培养液，混合后 1 000 g/min 离心 5 min， 弃上清，再重复清洗一次。 c) 对复苏后的细胞进行接种，接种密度以 5×105/mL 为宜。 6 细胞系的命名 细胞系命名采用6级命名法，按以下步骤进行： a) 中文名由采样的物种、品种、性别、采样组织、细胞系编号、培养代数组成。 b) 其缩写名则由物种英文名称的字首、品种名头两个字拼音字首、性别（公为 11、母为 12）、 采样组织的英文的字首、细胞系编号（用阿拉伯数字表示）、培养代数（F0-FN）组成。 c) 如从撒坝公猪耳缘组织采样所建立的成纤维细胞系 1 第 1 代细胞，其中文名为“撒坝公猪耳缘 成纤维细胞系 1 第 1 代细胞”，缩写名为“PSb11E1F1”，命名表参见附录 A 中表 A.3。 3 DB53/T 939—2019 附 录 A （资料性附录） 采样记录表、细胞冻存记录表、细胞系命名表 A.1 采样记录表 采样记录表见表A.1。 表A.1 采样记录表 物种 采 品种 样 年龄 记 性别 录 采样地点 采样部位 记录人： A A.2 细胞冻存记录表 细胞冻存记录表见表A.2。 表 A.2 细胞冻存记录表 细胞系名 冷冻日期 操作者 称 冻存容器编号 冷冻袋号码 冻存信息 每个冻存管的冻存量（mL） 冻存管的总数（个） 记录人： B A.3 细胞系命名表 细胞系命名见表A.3。 表A.3 细胞系命名表 中文名 物种 品种 性别 采样组织 细胞系编号 培养代数 缩写名 英文名字首 头两个字拼音字首 公为 11、母为 12 英文字首 阿拉伯数字 F0-FN _________________________________ 4 DB53/T 939－2019