ICS 65.120 B46 山 DB37 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3422—2018 混合型饲料添加剂中硫酸粘杆菌素的测定 高效液相色谱法 Determination of colistin sulfate in mixed feed additives - High performance liquid chromatography 2018 - 09 - 14 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 10 - 14 实施 发 布 DB37/T 3422—2018 前  言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省饲料质量检验所。 本标准主要起草人：张玮、宫玲玲、李会荣、张芸、孙延军、李俊玲。 I DB37/T 3422—2018 混合型饲料添加剂中硫酸粘杆菌素的测定高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了混合型饲料添加剂中硫酸粘杆菌素含量测定的高效液相色谱法。 本标准适用于混合型饲料添加剂〔以饲料原料稻壳粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀粉、小麦粉以及多 种饲料原料混合物（包括稻壳粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀粉、玉米芯粉、小麦粉、桔梗、甘草、白术、 赤药、知母、茯苓等混合）为载体 〕中硫酸粘杆菌素的测定。 本标准的检出限：硫酸粘杆菌素A为1.0 mg/kg ，硫酸粘杆菌素B为0.74 mg/kg ；定量限：硫酸粘 杆菌素A为2.0 mg/kg ，硫酸粘杆菌素B为1.49 mg/kg 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样中硫酸粘杆菌素用5 %草酸溶液提取，经固相萃取柱净化，丹磺酰氯衍生，高效液相色谱-荧光 检测法测定，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1 甲醇: 色谱纯。 4.2 硫酸粘杆菌素标准品: CAS：1264-72-8。硫酸粘杆菌素 A 含量≥44.6 % ，硫酸粘杆菌素 B 含量≥ 33.2 % 。 4.3 5 %草酸溶液：准确称取 50 g 草酸，用水溶解至 1000 mL 。 4.4 0.2 %乙酸溶液：准确吸取 2 mL 冰乙酸，用水稀释至 1000 mL 。 4.5 0.2 %甲酸水溶液：准确吸取 2 mL 甲酸，用水稀释至 1000 mL 。 4.6 盐酸溶液：盐酸+水= 9+100，V+V 。 4.7 乙腈甲酸水溶液：乙腈(色谱纯)+0.2 %甲酸水溶液(4.4)=2+8，V+V 。 4.8 丹磺酰氯溶液（3.0 mg/mL）:快速称取 0.30 g 丹磺酰氯（色谱纯）于 100 mL 棕色容量瓶中，用 乙腈(色谱纯)溶解并定容，现用现配。 注：丹磺酰氯对光和湿敏感不稳定。 1 DB37/T 3422—2018 4.9 碳酸钠缓冲溶液（pH=10.5）：c（Na2CO3）=0.1 mol/L 。准确称取 1.06 g 碳酸钠，加水 80 mL 溶解，用盐酸溶液（4.6）调节 pH 至 10.5 ，用水定容至 100 mL 。 4.10 盐酸甲胺溶液（20 mg/mL)：称取 2.0 g 盐酸甲胺，用水溶解并定容至 100 mL 。2 ℃～8 ℃保 存。 4.11 硫酸粘杆菌素标准贮备溶液：精密称取硫酸粘杆菌素标准品（4.2）适量（精确至 0.01 mg）， 置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈甲酸水溶液（4.7）定容，配成浓度为硫酸粘杆菌素 A 为 1.0 mg/mL、B 为 0.74 mg/mL（因标准品含量不同而不同）的标准贮备溶液。2 ℃～8 ℃保存，有效期为 6 个月。 4.12 硫酸粘杆菌素标准中间溶液：准确移取硫酸粘杆菌素标准贮备溶液（4.11）1.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈甲酸水溶液（4.7）定容至刻度。该溶液中硫酸粘杆菌素 A 的浓度为 100 g/mL、B 浓度为 74.4 g/mL 。2 ℃～8 ℃保存，有效期为 3 个月。 4.13 硫酸粘杆菌素标准工作溶液系列：准确移取硫酸粘杆菌素标准中间溶液（4.12）适量，用乙腈甲 酸水溶液（4.7）稀释成硫酸粘杆菌素 A 浓度分别为 0.10 g/mL 、0.20 g/mL、0.40 g/mL 、2.00 g/mL、 4.00 g/mL、20.0 g/mL 和 40.0 g/mL；硫酸粘杆菌素 B 浓度分别为 0.0744 g/mL、0.149 g/mL、 0.298 g/mL、1.49 g/mL、2.98 g/mL、14.9 g/mL、29.8 g/mL 的标准工作溶液系列。现用现配。 4.14 固相萃取柱：亲水亲脂平衡小柱 60 mg/3 mL ，或其它性能类似的小柱。 4.15 微孔滤膜：0.22 μm，有机系。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 高效液相色谱仪：配有荧光检测器。 分析天平：感量为 0.001 g 和感量为 0.01 mg 各 1 台。 恒温水浴锅：精度为 1 ℃ 。 离心机：转速不低于 8000 r/min 。 pH 计：精度为 0.01 。 多管涡旋振荡器。 固相萃取装置。 旋涡混合器。 6 样品 按 GB/T 20195 制备试样，粉碎过 0.45 mm 分析筛，充分混匀，装入磨口瓶中备用。 7 试验步骤 7.1 提取 称取试样2 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，准确加入15 mL 5 %草酸溶液（4.3），涡旋振 荡10 min ，于8000 r/min离心5 min ，上清液备用。 7.2 净化 固相萃取柱依次用 3 mL 甲醇（4.1）、3 mL 0.2 %甲酸水溶液（4.5）活化。准确吸取上清液(7.1)3 mL 过柱（流速＜1 mL/min），用 3 mL 0.2 %甲酸水溶液（4.5）淋洗，负压抽干，用 3 mL 乙腈甲酸水 溶液（4.7）洗脱，收集洗脱液，用乙腈甲酸水溶液（4.7）定容至 3 mL，涡旋混匀，待衍生。 2 DB37/T 3422—2018 7.3 衍生化 准确吸取净化液（7.2）0.2 mL于5 mL具塞试管中，准确加入0.2 mL碳酸钠缓冲溶液（4.9）, 0.4 mL 丹磺酰氯溶液（4.8），密闭涡旋混匀，避光于(25±1)℃水浴中反应40 min后，立即加入50 L盐酸甲 胺溶液（4.10）涡旋混合。衍生后的试液过0.22 μm滤膜后上机测定。衍生后的试液常温避光条件下24h 稳定。 另准确移取硫酸粘杆菌素标准工作溶液系列（4.13）各0.2 mL，同上述操作，进行衍生。 7.4 测定 7.4.1 液相色谱参考条件 a) b) c) d) e) f) 色谱柱： C8 柱， 柱长 150 mm ，内径 4.6 mm ，粒径 5 μm ，或性能相当者。 柱温：45 ℃ 。 波长：激发波长 344 nm ，发射波长 518 nm 。 流动相：甲醇（4.1）+0.2 %乙酸溶液（4.4）=86+14 。 流速：1.0 mL/min 。 进样量：50 L 。 7.4.2 定量测定 按照7.4.1给出的色谱参考条件，分别上机测定衍生后的硫酸粘杆菌素标准工作溶液系列（4.13， 从低浓度到高浓度进样）及试液（7.3），得到硫酸粘杆菌素A和B的峰面积。分别以标准工作溶液中硫 酸粘杆菌素A、B的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线多点校准或以标准工作溶液单点 进行定量。硫酸粘杆菌素标准工作溶液的高效液相色谱图参见附录A。 8 试验数据处理 试样中硫酸粘杆菌素A或硫酸粘杆菌素B的含量Xi，以质量分数表示，单位为毫克每千克(mg/kg)， 按式(1)计算： Xi  C  V1  V2 V3  m ......................................................................... (1) 式中： C ——试样中硫酸粘杆菌素 A 或硫酸粘杆菌素 B 峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（g/mL） ； V1 ——试样中加入提取液的体积，单位为毫升（mL）； V2 ——衍生前最终定容体积，单位为毫升（mL）； V3 ——加入固相萃取柱中提取液的体积，单位为毫升（mL）； m ——试料的质量，单位为克（g） 。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的20 % 。 3 DB37/T 3422—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 硫酸粘杆菌素标准溶液的高效液相色谱图 硫酸粘杆菌素标准溶液的高效液相色谱图见图A.1 。 注：1——硫酸粘杆菌素B；2——硫酸粘杆菌素A。 图 A.1 硫酸粘杆菌素标准溶液（硫酸粘杆菌素 A 浓度为 1.0 g/mL，硫酸粘杆菌素 B 浓度为 0.744 g/mL）色谱图 _________________________________ 4