ICS 65.120 B46 山 DB37 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3421—2018 混合型饲料添加剂中氟喹诺酮类药物的测 定高效液相色谱法 Determination of fluoroquinolones in mixed feed additives-High performance liquid chromatography 2018 - 09 - 14 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 10 - 14 实施 发 布 DB37/T 3421—2018 前  言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省饲料质量检验所。 本标准主要起草人：张芸、孙延军、张玮、宫玲玲、李俊玲。 I DB37/T 3421—2018 混合型饲料添加剂中氟喹诺酮类药物的测定高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了用高效液相色谱仪测定混合型饲料添加剂中氟喹诺酮类药物诺氟沙星、氧氟沙星、环 丙沙星、甲磺酸达氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星的方法。 本标准适用于〔以饲料原料稻壳粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀粉、以及多种饲料原料混合物（包括 稻壳粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀粉、桔梗、甘草、白术、赤药、知母、茯苓等混合）为载体 〕的混 合型饲料添加剂中氟喹诺酮类药物的测定。 诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星检出限为0.15 mg/kg ，定量限为0.5 mg/kg ； 甲磺酸达氟沙星检出限为0.05 mg/kg ，定量限为0.15 mg/kg 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样中的氟喹诺酮类药物用盐酸甲醇溶液提取，高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯。水为符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1 甲醇。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 乙腈水溶液：乙腈+水=1+9，V+V 。 4.4 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。取浓盐酸 9 mL 缓慢加入 1000 mL 水中，摇匀。 4.5 盐酸甲醇溶液：盐酸溶液（4.4）+甲醇=8+2 ，V+V 。 4.6 柠檬酸-乙酸铵缓冲溶液：称取 10.56 g 柠檬酸和 7.87 g 乙酸铵溶解于约 800 mL 水中，用冰乙酸 或三乙胺调节 pH 至 4.0，用水定容至 1000 mL。过 0.22μm 滤膜，备用。 4.7 氢氧化钠溶液：c（NaOH）=30 mmol/L。称取 0.12 g 氢氧化钠，用水溶解并定容至 100 mL 。 4.8 诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、甲磺酸达氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星标准品：纯度及 CAS 号 见附录 B 。 4.9 氟喹诺酮类药物标准储备液（1 mg/mL）：准确称取诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、甲磺酸达氟 沙星、恩诺沙星和沙拉沙星各 10 mg(准确至 0.0001 g)于 10 mL 棕色容量瓶中，加 30 mmol/L 氢氧化钠 溶液溶解定容。2 ℃～8 ℃避光保存，有效期为 6 个月。 1 DB37/T 3421—2018 4.10 氟喹诺酮类药物标准工作液Ⅰ（100 µg/mL）：准确移取氟喹诺酮类药物标准储备液 1mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀释定容。2 ℃～8 ℃保存，有效期为 6 个月。 4.11 氟喹诺酮类药物标准工作液Ⅱ（10 µg/mL）：准确移取氟喹诺酮类药物标准工作液Ⅰ1mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀释定容。2 ℃～8 ℃保存，有效期为 6 个月。 4.12 氟喹诺酮类药物标准系列溶液：取适量上述标准工作液Ⅱ于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈水溶 液（4.3）配制成标准系列溶液，浓度分别为 0.01 µg/mL、0.02 µg/mL、0.05 µg/mL、0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.5 µg/mL、1 µg/mL，5 µg/mL。现用现配。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 高效液相色谱仪：配荧光检测器。 电子天平：感量 0.001 g 和 0.01 mg 。 旋涡混合器。 离心机：转速不低于 5000 r/min 。 微孔滤膜：0.22 μm，水相。 6 样品 按GB/T 20195制备试样，粉碎过0.45 mm试验筛，充分混匀，装入磨口瓶中备用。 7 试验步骤 7.1 提取 准确称取试样2 g（精确至0.001 g），置于50 mL具塞离心管中，准确加入盐酸甲醇溶液(4.5)10 mL , 涡旋振荡10 min 。于离心机5000 r/min离心10 min 。取上清液过0.22μm滤膜，备用。 7.2 测定 7.2.1 高效液相色谱参考条件 a) b) c) d) e) f) 色谱柱：C18，柱长 150 mm ，内径 4.6 mm ，粒径 2.7 µm ，或性能相当者； 流动相：柠檬酸-乙酸铵缓冲溶液（4.6）+乙腈（4.2），梯度洗脱程序见表 1； 流速：0.7 mL/min ； 柱温：50 ℃ ； 进样量：20 µL ； 波长：激发波长 278 nm ；发射波长 465 nm 。 表 1 梯度洗脱程序 时间（min） 乙腈（%） 柠檬酸-乙酸铵缓冲溶液（%） 0 9 91 12 9 91 20 20 80 20.1 90 10 2 DB37/T 3421—2018 表1 梯度洗脱程序 （续） 时间（min） 乙腈（%） 柠檬酸-乙酸铵缓冲溶液（%） 25 90 10 25.1 9 91 30 9 91 7.2.2 定量测定 按照7.2.1给出的色谱参考条件，分别上机测定标准系列溶液（从低浓度到高浓度进样）和试样溶 液中氟喹诺酮类药物的峰面积响应值，以标准系列溶液做单点或多点校准进行定量，试样溶液中氟喹诺 酮类药物的峰面积响应值应在标准工作曲线测定的线性范围内，超出线性范围的则用盐酸甲醇溶液(4.5) 适当稀释后再进样分析。甲磺酸达氟沙星线性范围0.01 µg/mL～1 µg/mL ，诺氟沙星、氧氟沙星、环 丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星线性范围0.02 µg/mL～5 µg/mL 。氟喹诺酮类药物标准溶液图谱参见附 录A 。 8 试验数据处理 试样中氟喹诺酮类药物的含量Xi，以质量分数表示，单位为毫克每千克(mg/kg)，按式（1）计算： Xi  ci  V  n ............................................................................. (1) m 式中： V —提取液体积，单位为毫升（mL)； ci—试样中氟喹诺酮类药物峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL)； m —试样质量，单位为克(g)； n—稀释倍数。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的20 % 。 3 DB37/T 3421—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 氟喹诺酮类药物标准溶液色谱图 氟喹诺酮类药物标准溶液色谱图见图A.1 。 注：1——诺氟沙星；2——氧氟沙星；3——环丙沙星；4——甲磺酸达氟沙星；5——恩诺沙星；6——沙拉沙星。 图 A.1 氟喹诺酮标准溶液色谱图（1.0 µg/mL） 4 DB37/T 3421—2018 BB 附 录 B （资料性附录） 氟喹诺酮类药物的纯度及 CAS 号 氟喹诺酮类药物的纯度及CAS号见表B.1 。 表 B.1 氟喹诺酮类药物的纯度及 CAS 号 序号 标准品名称 纯度要求 CAS 号 1 诺氟沙星 ≥97% 70458-96-7 2 氧氟沙星 ≥97% 82419-36-1 3 环丙沙星 ≥97% 85721-33-1 4 甲磺酸达氟沙星 ≥97% 119478-55-6 5 恩诺沙星 ≥97% 93106-60-6 6 沙拉沙星 ≥97% 98105-99-8 _________________________________ 5