ICS  65.120 B 46 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3190—2018 动物尿液中克伦特罗等 8 种β-兴奋剂 的残留测定 胶体金免疫层析法 Detection of 8 β-agonists such as Clenbuterrol residues in animal urine Colloidal gold immunochromatographic method 文稿版次选择 2018 - 08 - 08 发布 安徽省质量技术监督局 2018 - 09 - 08 实施 发 布 DB34/T 3190—2018 前    言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省兽药饲料监察所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、宁国市金东坊农业开展有限公司、宁国市金鼎家庭农场、 浙江迪恩生物科技股份有限公司、铜陵市义安区动物卫生监督所、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、 安徽省水产技术推广总站、阜阳市动物卫生监督所。 本标准主要起草人：吴昊、许世富、李东风、孙德祥、潘孝成、张利亚、方芳、徐月清、郭恒心、 龙中原、胡群芳、郑举、吴兵、何为俊、郑新勇、钱昌银、程扬、吴海芬、宋亚伟、王群、汪百才、石 翠芳。 I DB34/T 3190—2018 动物尿液中克伦特罗等 8 种β-兴奋剂的残留测定 胶体金免疫层析法 1 范围 本标准规定了动物尿液中的克伦特罗、沙丁胺醇、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、妥布特罗、特 布他林、盐酸氯丙那林 8 种 β-兴奋剂的胶体金免疫层析法。 本标准适用于动物尿液中克伦特罗等8种β-兴奋剂的检测。 本标准检测限：克伦特罗、沙丁胺醇、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、妥布特罗、特布他林均为 3 μg/L；盐酸氯丙那林为 8 μg/L。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 本试验采用胶体金竞争抑制法。 将氯金酸用枸橼酸钠还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。 硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，将样本滴加在胶体金检测条样品垫一端，使液 体慢慢向吸水纸另一端渗移。在样本移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色 而显示出来。样本中的 β-兴奋剂在流动的过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸 纤维素（NC）膜检测线上的 β-兴奋剂人工抗原的结合，使检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测 线显紫红色，结果为阴性。 4 试剂和材料 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 注：不同检测卡制造商间的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。 4.1 β-兴奋剂胶体金检测卡（八合一）组成 4.1.1 β-兴奋剂类（八合一）多克隆抗体。 4.1.2 胶体金。胶体金溶液采用氯金酸还原法制备，应为带负电的紫红色疏水胶体金溶液，金颗粒大 小应在 30 nm～60 nm 之间。 4.1.3 硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜表面应平整、光滑、白净，没有划痕、凹印、小孔、水迹、橘皮 状或其他肉眼能见的瑕疵，无灰尘、油渍或其他杂物。硝酸纤维素膜宽度为（25.4±0.5）mm，长度在 （100±2）mm，厚度在（185±19）μm，毛细流速度为（180±45）s/40 mm。 1 DB34/T 3190—2018 4.1.4 聚酯纤维膜。聚酯纤维膜表面形状应为基本均匀的矩形，无明显歪斜现象。色泽好，白色，表 面洁净，均匀度好，无破损，无起皱，无污点，无色斑，无霉点，无异味，无杂质及灰尘。聚酯纤维膜 2 重量在（98.3±10.0）g/m ，厚度在（0.42±0.07）mm，长度为（305.0±2.5）mm，宽度为（254.0±2.5） mm。 4.1.5 吸水纸。 4.1.6 底板。 4.1.7 塑料盒。 4.1.8 塑料吸管。 4.2 电子天平：感量 0.1 mg。 4.3 离心机：≥5 000 rpm。 4.4 阴性对照：取不含上述 8 种 β-兴奋剂尿液为阴性对照。 4.5 阳性对照 4.5.1 克伦特罗阳性尿样：取克伦特罗标准溶液用空白尿液稀释为 3 μg/L。 4.5.2 沙丁胺醇阳性尿样：取沙丁胺醇标准溶液用空白尿液稀释为 3 μg/L。 4.5.3 西布特罗阳性尿样：取西布特罗标准溶液用空白尿液稀释为 3 μg/L。 4.5.4 马布特罗阳性尿样：取马布特罗标准溶液用空白尿液稀释为 3 μg/L。 4.5.5 溴布特罗阳性尿样：取溴布特罗标准溶液用空白尿液稀释为 3 μg/L。 4.5.6 妥布特罗阳性尿样：取妥布特罗标准溶液用空白尿液稀释为 3 μg/L。 4.5.7 特布他林阳性尿样：取特布他林标准溶液用空白尿液稀释为 3 μg/L。 4.5.8 盐酸氯丙那林阳性尿样：取盐酸氯丙那林标准溶液用空白尿液稀释为 8 μg/L。 5 检测步骤 5.1 样品制备 取新鲜尿液或回至室温的冷冻/冷藏尿液，直接用于检测。若尿液混浊，于 5000 rpm 离心 5 min， 取上清液进行检测。 5.2 溶液制备 5.2.1 克伦特罗储备液和标准溶液：准确称取克伦特罗对照品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的 储备液，-18℃冰箱中贮存备用，有效期 3 个月；取克伦特罗储备液，用水稀释至 100 μg/L，4℃中贮 存备用，有效期 1 个月。 5.2.2 沙丁胺醇储备液和标准溶液：准确称取沙丁胺醇对照品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的 储备液，-18℃冰箱中贮存备用，有效期 3 个月；取沙丁胺醇储备液，用水稀释至 100 μg/L，4℃中贮 存备用，有效期 1 个月。 5.2.3 西布特罗储备液和标准溶液：准确称取西布特罗对照品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的 储备液，-18℃冰箱中贮存备用，有效期 3 个月；取西布特罗储备液，用水稀释至 100 μg/L，4℃中贮 存备用，有效期 1 个月。 5.2.4 马布特罗储备液和标准溶液：准确称取马布特罗对照品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的 储备液，-18℃冰箱中贮存备用，有效期 3 个月；取马布特罗储备液，用水稀释至 100 μg/L，4℃中贮 存备用，有效期 1 个月。 2 DB34/T 3190—2018 5.2.5 溴布特罗储备液和标准溶液：准确称取溴布特罗对照品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的 储备液，-18℃冰箱中贮存备用，有效期 3 个月；取溴布特罗储备液，用水稀释至 100 μg/L，4℃中贮 存备用，有效期 1 个月。 5.2.6 妥布特罗储备液和标准溶液：准确称取妥布特罗对照品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的 储备液，-18℃冰箱中贮存备用，有效期 3 个月；取妥布特罗储备液，用水稀释至 100 μg/L，4℃中贮 存备用，有效期 1 个月。 5.2.7 特布他林储备液和标准溶液：准确称取特布他林对照品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的 储备液，-18℃冰箱中贮存备用，有效期 3 个月；取特布他林储备液，用水稀释至 100 μg/L，4℃中贮 存备用，有效期 1 个月。 5.2.8 盐酸氯丙那林储备液和标准溶液：准确称取盐酸氯丙那林对照品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的储备液，-18℃冰箱中贮存备用，有效期 3 个月；取盐酸氯丙那林储备液，用水稀释至 100 μg/L， 4℃中贮存备用，有效期 1 个月。 5.3 样品检测 5.3.1 从包装袋中取出 β-兴奋剂胶体金检测卡（八合一），置于平整的台面上待测，检测卡应即开即 用（1 小时内使用）。 5.3.2 用塑料吸管（4.2.8）垂直滴加 2 滴无气泡待检尿样（60 µL～80 µL）于加样孔（S）内，每批 需做阴性对照和阳性对照各一个，加样方法同待测样品。 5.3.3 加样后 5 min～10 min 观察结果。 6 结果判断 6.1 方法确认 6.1.1 阴性对照在检测区（T）出现紫红色条带，所有阳性对照在检测区（T）均不出现紫红色条带， 且质控区（C）出现一条紫红色条带，说明检测卡有效，可进行检测。 6.1.2 如阴性对照检测区（T）不出现红色条带，或阳性对照检测区（T）出现红色条带，或质控区（C） 不出现一条紫红色条带，说明检测卡无效，不能进行检测。 6.2 测定结果 6.2.1 阳性（+）：仅质控区（C）出现一条紫红色条带，在检测区（T）内无紫红色条带出现。阳性结 果表明：样本中至少有克伦特罗等 8 种 β-兴奋剂类药物中某一种 β-兴奋剂类药物含量在检测限以上。 6.2.2 阴性（-）：两条紫红色条带出现。一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内。阴性 结果表明：样本中克伦特罗等 8 种 β-兴奋剂类药物含量均在检测限以下。 6.2.3 无效：质控区（C）未出现紫红色条带，表明本次检测无效（失效原因包括操作过程不当或检测 卡已过有效期等）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，更换检测卡重新检测。参见附录 A。 7 结果确认 阳性样品应使用气相色谱串联质谱法（GC-MS）或液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）进行确认。 3 DB34/T 3190—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 检测结果判断示意图 阴性（-） 阳性（+） 图A.1 无效 示意图 _________________________________ 4