ICS 65.120 B46 山 DB37 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3420—2018 混合型饲料添加剂中雌二醇的测定高效液 相色谱法 Determination of estradiol in mixed feed additives—High performance liquid chromatography 2018 - 09 - 14 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 10 - 14 实施 发 布 DB37/T 3420—2018 前  言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省饲料质量检验所。 本标准主要起草人：孙延军、张芸、张玮、门晓冬、李俊玲。 I DB37/T 3420—2018 混合型饲料添加剂中雌二醇的测定高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了混合型饲料添加剂中雌二醇含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于不含无机载体的混合型饲料添加剂〔 以饲料原料稻壳粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀 粉、玉米芯粉以及多种饲料原料混合物（包括稻壳粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀粉、玉米芯粉、桔梗、 甘草、白术、赤药、知母、茯苓等混合）为载体 〕中雌二醇的测定。 本标准的检出限为0.5 mg/kg ，定量限为1.0 mg/kg 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样中雌二醇用乙腈溶液提取，经固相萃取柱净化后，上高效液相色谱仪测定，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1 乙腈: 色谱纯。 4.2 甲醇: 色谱纯。 4.3 雌二醇标准品：CAS 号: 50-28-2。雌二醇含量≥98.5% 。 4.4 5%甲醇溶液：准确量取 5 mL 甲醇（4.2），用水稀释至 100 mL 。 4.5 乙腈水溶液：乙腈+水=4+6,V+V 。 4.6 雌二醇标准贮备溶液：称取雌二醇标准品（4.3）10 mg（精确至 0.0001 g），置于 10 mL 容量瓶 中，用甲醇（4.2）定容，配成浓度为 1 mg/mL 的标准贮备溶液。2 ℃～8 ℃保存，有效期 6 个月。 4.7 雌二醇标准工作溶液：准确移取雌二醇标准贮备溶液（4.6）1 mL 置于 10mL 容量瓶中，用甲醇（4.2） 定容至刻度。该溶液雌二醇的浓度为 100 μg/mL 。2 ℃～8 ℃保存，有效期 3 个月。 4.8 雌二醇标准系列溶液：准确移取雌二醇标准工作溶液（4.7）适量，用乙腈水溶液（4.5）稀释成 浓度分别为 0.50 μg /mL 、1.00 μg /mL 、2.00 μg/mL、5.00 μg /mL、10.00 μg /mL、20.00 μ g /mL 的标准系列溶液。现用现配。 4.9 固相萃取柱：HLB 固相萃取柱（60 mg/3 mL），或其它等效柱。 4.10 微孔滤膜：0.22 μm，有机相。 1 DB37/T 3420—2018 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。 分析天平：感量为 0.001 g 和感量为 0.0001 g 各 1 台。 氮吹装置。 离心机，转速不低于 5000 r/min。 多管涡旋振荡器。 固相萃取装置。 旋涡混合器。 6 样品 按 GB/T 20195 制备试样，粉碎过 0.45 mm 分析筛，充分混匀，装入磨口瓶中备用。 7 试验步骤 7.1 试样提取 称取试样2 g（精确至0.001g）于50 mL离心管中，准确加入20 mL 乙腈（4.1），涡旋振荡20 min 后，在不低于5000 r/min条件下离心5 min ，准确移取上清液5 mL于10 mL试管中，50 ℃下氮气吹至约 2 mL，加入4 mL水，涡旋振荡以充分溶解残余物，为备用液。 7.2 净化 固相萃取柱（4.9），依次用 3 mL 甲醇（4.2）、3 mL 水活化。全部备用液(7.1)过柱，依次用 3 mL 水、3 ml 5 %甲醇溶液（4.3）淋洗，抽干或挤干。用 5 mL 甲醇（4.2）洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀， 50 ℃下氮气吹干。准确加入乙腈水溶液（4.5）1 mL ，涡旋振荡以充分溶解，过 0.22 μm 滤膜，为 待测液。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件 色谱柱： C18，柱长 150 mm ，内径 4.6 mm ，粒径 3.5 μm ，或性能相当者。 柱温：40 ℃ 。 波长：225 nm 。 流动相：A 为乙腈，B 为水，梯度洗脱程序见表 1。 流速：1.0 mL/min 。 进样量：20 L 。 a) b) c) d) e) f) 表 1 梯度洗脱程序 序号 时间，min A，% B，% 1 0 40 60 2 4 40 60 3 4.1 90 10 2 DB37/T 3420—2018 表1 梯度洗脱程序 （续） 序号 时间，min A，% B，% 4 7 90 10 5 7.1 40 60 6 10 40 60 7.3.2 定量测定 按照7.3.1给出的色谱参考条件，上机测定雌二醇标准系列溶液（从低浓度到高浓度进样）及待测 液（7.2），以色谱峰面积进行单点或多点校正定量，待测液中目标化合物的响应值应在标准曲线线性 范围内；若超出线性范围，待测液则用乙腈水溶液（4.5）适当稀释，过滤膜后再上机测定。雌二醇标 准溶液的高效液相色谱图参见附录A。 8 试验数据处理 试样中雌二醇的含量X，以质量分数表示，单位为毫克每千克(mg/kg)，按式(1)计算： X  C V1 V2 …………………………………………………（1） V3  m 式中： C ——试液中雌二醇峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； V1 ——试样中加入提取液的体积，单位为毫升（mL）； V2 ——上机前最终定容体积，单位为毫升（mL）； V3 ——移取 7.1 中上清液体积，单位为毫升（mL） ； m ——试料的质量，单位为克（g） 。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的20 % 。 3 DB37/T 3420—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 雌二醇标准溶液的高效液相色谱图 雌二醇标准溶液（5.0 g/mL）色谱图见图A.1 。 图 A.1 雌二醇标准溶液（5.0 g/mL）色谱图 _________________________________ 4