ICS 65.020.30 B43 怒 DB 江 州 地 方 标 准 DB 5333/T 12.5—2018 兰坪乌骨绵羊养殖技术规范 第 5 部分：胚胎移植技术 2018 - 06 - 20 发布 怒江傈僳族自治州质量技术监督局 2018 - 09 - 20 实施 发 布 DB5333/T 12.5—2018 前  言 《兰坪乌骨绵羊养殖技术规范》分为以下6个部分： ——第 1 部分：品种； ——第 2 部分：区域布局； ——第 3 部分：饲养管理； ——第 4 部分：饲草加工调制技术； ——第 5 部分：胚胎移植技术； ——第 6 部分：产品质量。 本部分为DB5333/T12的第5部分。 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由云南省兰坪县兰坪乌骨绵羊养殖农业标准化示范区项目领导小组提出。 本标准由怒江州质量技术监督局归口。 本标准主要起草人：洪琼花、李俊东、李东江、权国波、张兴仁、和四池、李庆亮、张韩。 I DB5333/T 12.5—2018 兰坪乌骨绵羊养殖技术规范 第 5 部分：胚胎移植技术 1 范围 本标准规定了兰坪乌骨绵羊术语和定义、胚胎移植的基本原则、供体羊、供体羊的超排与配种、胚 胎回收、胚胎质量鉴定、供受体羊的同期发情处理、胚胎移植、妊娠受体羊的饲养管理。 本规范适用于兰坪乌骨绵羊的超数排卵及胚胎移植的各个环节。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 826 绵羊胚胎移植技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 供体羊 提供卵子或胚胎的优秀繁殖母羊。 3.2 受体羊 接受胚胎（移植）的母羊。 3.3 同期发情 使用外源激素来调控一群母羊的发情时间，使之在预定的时间内集中发情并排卵。 3.4 超数排卵（简称超排） 在母羊发情周期的适当时间，使用外源激素诱导更多的卵泡正常发育，并多排卵。 3.5 胚胎移植 将受精卵（胚胎）移植到受体子宫角内。 4 4.1 4.2 胚胎移植的基本原则 胚胎供体与受体在分类学上属于同一物种。 胚胎发育阶段与受体母羊发情时间上的一致性,即供、受体母羊发情时间相差不超过 24 小时。 1 DB5333/T 12.5—2018 4.3 胚胎发育阶段与受体生殖道解剖位置的一致性,即从供体母羊输卵管收集到的胚胎应移植到受体 供体羊的选择与饲养管理 5 供体羊 5.1 供体羊的选择 供体羊应符合兰坪乌骨绵羊的典型特征，谱系清楚，遗传性稳定，种用价值高。 体质健壮，膘情中等。 繁殖机能正常、无遗传和传染性疾病。 年龄在 2 岁～6 岁。 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.2 供体羊的饲养管理 5.2.1 单独组群，专人管理。 5.2.2 保持饲养环境稳定，避免应激反应，期间不得任意变换草料和管理程序。 5.2.3 加强饲养，在优质牧草地放牧，补充高蛋白、维生素和矿物质，并供给盐和清洁的饮水，保证 正常的营养平衡。 5.2.4 参照 NY/T 826-2004 绵羊胚胎移植技术规程，详细记录羊只的饲喂方式、饲料配方，以及疾病 诊治、驱虫羊只的年龄、胎次、体重、上次发情时间、上次产羔时间、断奶时间、上次冲胚时间等情况。 5.2.5 注射维生素 A、D、E 合剂，促发情、提高妊娠免疫。 6 供体羊的超排与配种 6.1 超排处理 6.1.1 超排激素 FSH（促卵泡素）、PGF2a、CIDR（孕酮阴道栓）、PMSG（孕马血清）。 6.1.2 超排方法 6.1.2.1 FSH+PG 法 在自然发情周期的任意一天给母羊埋置孕酮阴道栓，第11天开始采用递减法每天早晚各注射一次 FSH，连续注射4天，在第5次注射FSH时，同时肌注PGF2α。 6.1.2.2 FSH+PMSG 法 在自然发情周期的任意一天给母羊埋置孕酮阴道栓，第11天开始采用递减法每天早晚各注射一次 FSH，连续注射4天，在第1次注射FSH时，同时注射PMSG 300IU。 6.2 发情鉴定 在注射第七针FSH的同时撤除孕酮阴道栓，FSH注射完毕，随即每天早晚用试情公羊（带试情布或结 扎输精管）对超排供体羊进行试情，以母羊站立接受试情公羊爬跨作为发情的标准。 6.3 配种 供体母羊发情后，每日上、下午各配种一次，直至发情结束。 2 DB5333/T 12.5—2018 7 胚胎回收 7.1 采卵（胚胎）时间 以供体母羊发情日为0天，在5.5～7天或2～3天用手术法分别从子宫和输卵管回收胚胎或受精卵。 7.2 采卵（胚胎）前的准备 7.2.1 手术室设置及要求 在手术室内设专门套间，作为胚胎操作室。手术室要求洁净明亮，光线充足、无尘、地面用水泥或 砖铺成，配备照明用电。室内温度应保持在20～25℃。手术室定期用3～5%煤酚皂溶液喷洒消毒，手术 前用紫外灯照射1～2小时，手术过程中不能随意开启门窗。 7.2.2 回收胚胎所需主要器械 羊胚胎移植主要器械与设备见附录C。 7.2.3 回收胚胎所需药品 新洁尔灭、静松灵、0.9%生理盐水、酒精、碘酒、青霉素、链霉素等。 7.2.4 冲胚液的配制 基液：杜氏磷酸缓冲液（PBS），配方见附录A。也可用进口PBS粉配制。冲胚液：含1%FCS（胎犊牛 血清）或CS（犊牛血清）的PBS液。 7.3 采卵（胚胎）步骤 7.3.1 7.3.1.1 供体羊准备 停食 供体羊手术前应停食24～48小时，可供给适量饮水。 7.3.1.2 供体羊的保定和麻醉 供体羊仰放在手术保定架上，四肢固定。按每公斤体重0.03～0.05ml 2%静松灵肌注麻醉。 7.3.1.3 手术部位及消毒 手术部位一般选择乳房前肢中线部（在两条乳静脉之间）或腹中浅的两侧均可。用电剪或毛剪剪去 术部毛，刮净毛茬，分别用清水和消毒液清洗局部，然后由里向外涂以2%～4%的碘酒，待干后再用75% 的酒精棉脱碘。盖上创巾，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。 7.3.2 术者的准备 术者应将指甲剪短，并锉光滑，穿清洁手术服、戴工作帽和口罩。术者将手指尖到肘部先后在温水、 0.1%的新洁尔灭液中浸洗5分钟，双手消毒后，要保持供手姿势，避免与未消毒过的物品接触，一旦接 触，即应重新消毒。 7.3.3 7.3.3.1 手术法回收卵（胚胎） 组织分离 3 DB5333/T 12.5—2018 避开较大血管和神经、切口边缘与切面整齐、切口方向与组织走向尽量一致、依组织层次分层切开、 切口长约5厘米。 7.3.3.2 切开皮肤 用右手的食指和拇指在预定切口的两侧将皮肤撑紧固定，右手用餐刀式执刀，由预定切口起点至终 点一次切开，使切口深度一致，边缘平直。 7.3.3.3 切开皮下组织 皮下组织用执笔式执刀法切开，切时可先切一小口，再用外科剪刀剪开。 7.3.3.4 切开肌肉 7.3.3.5 用钝性分离法。按肌肉纤维方向用刀柄刺开一小切口，然后将刀柄末端或用手指伸入切口， 沿纤维方向整齐分离开，避免损伤肌肉的血管和神经。 7.3.3.6 切开腹膜 先用镊子提起腹膜，在提起部位作一切口，然后用另一只手的手指深入腹膜，用外科剪将腹膜剪开。 术者将食指及中指由切口伸入腹腔，在骨盆腔、膀胱周围触摸子宫角，并将卵巢、子宫引出切口外，记 录两侧卵巢黄体和滤泡数。 7.3.3.7 止血 毛细血管出血用沙布轻压出血处即可，小血管用止血钳止血，较大血管除用止血钳夹住暂时止血外， 必要时还需用缝合线结扎止血。 7.3.3.8 7.3.3.8.1 采卵（胚胎）方法 输卵管法 供体羊发情后2～3天从输卵管采集2～8细胞胚胎，进行鲜胚移植。方法：将冲卵管一端由输卵管伞 部的喇叭口插入，约2～3厘米深，另一端接集卵皿，用注射器吸取37℃的冲卵液5～10ml，在子宫角靠 近输卵管的部位，将针头朝输卵管方向扎入，一人操作，一只手的手指在针头后方捏紧子宫角，另一只 手推注射器，冲卵液即由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流至集卵皿。此法优点是卵的回收率高，冲 卵液用量小，检卵省时间。缺点是容易造成输卵管，特别是伞部的粘连。 7.3.3.8.2 子宫法 在超排母羊发情后5.5～7天从子宫采集桑椹胚至扩张囊胚，胚胎可用于鲜胚移植、冷冻、分割及其 它研究。方法：用带胶管的肠钳夹在一侧子宫角基部，冲卵针头（钝形）从子宫角尖端插入，当确认针 头在管腔内，进退通畅时，把冲卵液缓慢注入子宫腔，待子宫角适度膨胀后，用子宫导卵管从子宫角基 部导入子宫腔，导卵管另一端接平皿，同时轻轻挤压子宫角前端，将冲卵液导出，每侧子宫角需要约30ml 冲卵液。另一侧子宫角用同样方法冲洗。子宫法对输卵管损伤较小，尤其不涉及伞部，但卵回收率较输 卵管法低，用液较多，检卵较费时。 7.3.3.9 7.3.3.9.1 4 缝合 要求 DB5333/T 12.5—2018 缝合前创口必须彻底止血，用加肝素的灭菌生理盐水冲洗，清除手术过程中形成的凝块等；按组织 层次分层缝合，对合严密、创缘不内卷和外翻，缝合进针和出针要距创缘0.5厘米左右，针间距要均匀， 所有结要打在同一侧。 7.3.3.9.2 方法 采用三层缝合法，即腹膜、肌肉连续缝合；皮肤结节缝合，针角间距1厘米。在肌肉与皮肤之间撒 适量青、链霉素粉，以防创口感染。 7.3.3.10 术后处理 采卵完毕后，用37℃灭菌生理盐水+肝素湿润母羊子宫，冲去凝血块，再涂少许灭菌液体石蜡，以 防粘连，将器官复位。 8 胚胎质量鉴定 8.1 检卵（胚胎）操作要求 检卵者应熟悉体视镜的结构，做到熟练使用。找卵的顺序应由低倍到高倍，一般在10倍左右即能发 现卵子，对胚胎鉴定分级时再转向高倍。 8.2 找卵（胚胎）要点 根据卵子的比重、大小、形态和透明带折光性等特点找卵。卵子的比重比冲卵液大，一般位于集卵 皿的底部；山羊卵直径为150～200μm，是一球形体，在光镜下呈圆形，其外层是透明带，镜检找到的 卵（胚）数应和卵巢上排卵点的数量大致相当。 8.3 检卵（胚胎）方法 将检出的胚胎吸入盛有保存液的Φ35mm培养皿中，在培养皿中的不同位置冲洗胚胎3～5次，然后把 全部卵移至另一个培养皿；每换一个培养皿时应换新的玻璃吸管，一个供体的卵（胚）放在同一个皿内。 8.4 胚胎的质量鉴定——形态学方法 8.4.1 胚胎的发育阶段，见早期胚胎的发育形态模式图附录 E。 8.4.2 发情授精后 2～3 天从输卵管回收的卵，发育阶段