ICS 65.020.01 B 16 陕 DB61 西 省 地 方 标 准 DB 61/T 1134—2018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法 Detection and identification of Tomato yellow leaf curl virus 2018 - 04 - 10 发布 陕西省质量技术监督局 2018 - 05 - 10 实施 发 布 DB61/T 1134—2018 目  次 前  言.............................................................................................................................................................. II 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件.............................................................................................................................................1 3 番茄黄化曲叶病毒基本信息.........................................................................................................................1 4 方法原理......................................................................................................................................................... 1 5 实验用仪器设备、用具及试剂.....................................................................................................................1 6 取样和样品制备.............................................................................................................................................2 7 检测方法......................................................................................................................................................... 2 8 结果判定......................................................................................................................................................... 2 9 结果记录与样品、资料保存.........................................................................................................................2 10 安全............................................................................................................................................................... 3 附录 A（规范性附录） TYLCV 相关资料.........................................................................................................4 附录 B（规范性附录） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法....................................................................... 7 附录 C（规范性附录） 普通 PCR 检测方法................................................................................................. 11 附录 D（规范性附录） 实时荧光 PCR 检测方法......................................................................................... 14 附录 E（规范性附录） 生物学接种..............................................................................................................16 I DB61/T 1134—2018 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由陕西省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：陕西省生物农业研究所、陕西省园艺蚕桑技术工作站、陕西学前师范学院。 本标准主要起草人：李英梅、杨苗苗、王周平、刘晨、张伟兵、张锋、洪波、陈志杰、张淑莲。 本标准由陕西省生物农业研究所负责解释。 本标准首次发布。 联系信息如下： 单位：陕西省生物农业研究所 电话：029—82291059 地址：西安市咸宁中路125号 邮编：710043 II DB61/T 1134—2018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法 1 范围 本标准规定了番茄黄化曲叶病毒酶联免疫吸附DAS-ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于番茄种苗及传毒介体中携带的番茄黄化曲叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 GB/T 23629-2009 引进植物病原生物安全控制技术要求 3 番茄黄化曲叶病毒基本信息 中文名：番茄黄化曲叶病毒 英文名：tomato yellow leaf curl virus 英文缩写：TYLCV 分类地位：双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus） 番茄黄化曲叶病毒其他信息见附录A。 4 方法原理 通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR进行检测 鉴定。 5 实验用仪器设备、用具及试剂 5.1 仪器设备 酶联检测仪、洗板机、高速冷冻离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电子天平（感量，1/10000g）、 电泳仪、电泳槽、紫外投射仪、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、液氮罐、隔离温室等。 5.2 用具 可调式微量移液器（0.5μL、2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、96孔光化学PCR 反应板、酶联板、离心管、PCR管、研钵等。 5.3 试剂 酶联测定试剂，PCR检测试剂，除有特殊说明外，均为分析纯或生化试剂。 1 DB61/T 1134—2018 6 取样和样品制备 6.1 取样 6.1.1 疑似被 TYLCV 感染的番茄植株取样方法：取疑似发病植株顶部叶片 2 片～3 片，-20℃储存备用。 6.1.2 无 TYLCV 感染症状番茄植株取样方法：在番茄田随机选 5 点，每点随机选 5 株，每株取顶部叶 片 2 片～3 片，-20℃储存备用。 6.1.3 若在取样过程中发现烟粉虱，应随机采集烟粉虱，-20℃储存备用。 6.2 实验室样品制备 6.2.1 植物样品：将每份 10g 待测番茄叶片放入研钵后加入液氮研磨，取 100mg 按照植物基因组试剂 盒抽提番茄叶片总 DNA，-20℃保存所提 DNA。 6.2.2 烟粉虱样品：取单头烟粉虱按照动物基因组提取试剂盒抽提 DNA，-20℃保存所提 DNA。 7 检测方法 7.1 7.2 7.3 7.4 8 酶联免疫吸附测定方法见附录 B。 PCR 检测方法见附录 C。 实时荧光定量 PCR 检测方法见附录 D。 生物学测定方法见附录 E。 结果判定 8.1 样品经酶联免疫吸附、普通 PCR、实时荧光定量 PCR 三种方法之一检测为阴性时，判定样品不携 带 TYLCV。 8.2 普通 PCR、实时荧光定量 PCR 中的两种方法检测结果为阳性，应进行序列测定，如序列测定结果 证实与所检测的 TYLCV 一致，即可判定检出 TYLCV。 8.3 酶联测定为阳性后，普通 PCR 或实时荧光 PCR 检测结果为阳性可判定检出 TYLCV。必要时可进行 生物学测定，并进行复检。 9 结果记录与样品、资料保存 9.1 结果记录 检验结果应形成检验报告，内容包括取样品种、时间、地点、人员、样品类型，样品保存条件；实 验时间、地点、方法、结果，检验人员签字等。 9.2 样品保存 经检验确定携带TYLCV的样品保存在-80℃冰箱，标记样品并登记。 9.3 资料保存 酶联测定需有酶联极反应的原始数据，普通PCR检测需有电泳结果照片及序列测定报告，荧光定量 PCR检测需有扩增曲线图片，生物学测定需有鉴别寄主的症状图片。 2 DB61/T 1134—2018 10 安全 实验过程中的生物安全要求应严格按照GB 194