ICS 07.080 B 40 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1769—2019 代替蒙 DB 417—87 绵羊冷冻精液 Frozen sheep semen 2019-12-05 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-01-05 实施 发 布 DB15/T 1769—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准代替蒙 DB 417—87《羊冷冻精液》 。 本标准与蒙 DB 417—87《羊冷冻精液》相比，主要变化如下： ——增加了规范性引用文件(见第2章）； ——增加了试验方法(见第5章）； ——增加了判定规则(见第6章）； ——修改了适用对象(1987年版的引言；本版的第1章第2段）； ——修改了规格与质量(1987年版的第2章；本版的第4章）； ——修改了检查方法(1987年版的第3章；本版的附录A)； ——删除了羊冷冻精液的制作程序和使用方法(1987年版的第2章和第4章）； ——删除了评定受胎效果的方法（1987年版的附录A)； ——删除了羊冷冻精液包装颜色和公羊品种代号（1987年版的附录B)。 本标准附录A是规范性附录。 本标准由内蒙古自治区畜牧工作站提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本标准主要起草单位：内蒙古自治区畜牧工作站、内蒙古乐科生物技术有限公司、内蒙古赛诺种羊 科技有限公司。 本标准主要起草人：阿娜尔、海龙、苏雅、红海、高博、格力格桑、王建国、包花拉、宁策勒木格、 陈大勇、梁丽丽、孟怀德。 I DB15/T 1769—2019 绵羊冷冻精液 1 范围 本标准规定了绵羊冷冻精液的技术要求、检验方法、判定规则、标志、标签和随行文件等内容。 本标准适用于各品种绵羊的冷冻精液产品，以下简称冻精。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB 20557 山羊冷冻精液 GB/T 30396 牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输 3 技术要求 3.1 种公羊 具有种用价值公羊，体质健康，无遗传病，不允许有已发布的动物防疫法中所明确的二类疫病中的 任何一种。 3.2 新鲜精液 8 色泽乳白色或淡黄色。精子活力≥65 %，精子密度≥6×10 个/mL。精子畸形率≤15 %。 3.3 细管冻精外观 细管无裂痕，两端封口严密，标识清晰，信息齐全。 3.4 每剂量冻精解冻后 3.4.1 剂型、剂量 细管冻精：微型，≥0.18 mL。 3.4.2 精子活力 ≥35 %（即≥0.35）。 3.4.3 前进运动精子数 ≥1000 万个。 3.4.4 精子畸形率 ≤20 %。 1 DB15/T 1769—2019 3.4.5 菌落数 ≤800 个。 4 检验方法 4.1 外观 用目测法,其结果应符合 3.3 的规定。 4.2 剂量 检验按附录 A 中 A.2 规定的方法,其结果应符合 3.4.1 的规定。 4.3 解冻后每剂量精液 解冻方法及精子活力、前进运动精子数、精子畸形率、细菌菌落数的检验按照 A.3～A.6 规定的方 法，其结果应分别符合 3.4.2、3.4.3、3.4.4、3.4.5 的规定。 4.4 检验分类 4.4.5 常规检验 对冻精的单项目检验是型式检验的一部分，主要是在生产的冻精入库前和售出使用时的检验。 4.4.6 型式检验 对冻精全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准，也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监督 抽样检验时选定项的检验。 4.5 检验项目 4.4.5 常规检验 符合3.3和3.4.2的规定。 4.4.6 型式检验 符合3.3～3.4的规定。 5 判定规则 5.1 常规检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。 5.2 型式检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。 6 标志、标签和随行文件 6.1 标志、标签 2 DB15/T 1769—2019 6.4.5 细管标记 细管冻精应在管壁上依次印刷以下内容，并且印制标识要清楚：生产站名、公羊品种、生产日期或 批次、公羊号。种公羊的品种代号按照 GB 20557 的规定。 6.4.6 内标签 在贮精管、灭菌纱布袋上标注公羊个体号、品种、细管数量。 6.4.7 外标签 可参照 GB/T 30396 的规定执行。 6.2 随行文件 绵羊冷冻精液产品可提供的随行文件包括：种公羊系谱、检疫证明、冷冻精液检验合格证明、生产 者的生产经营许可证等。 3 DB15/T 1769—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 绵羊冷冻精液质量检验方法 A.1 导言 本附录规定了通用的绵羊冷冻精液质量检验方法，参照了 GB/T 4789.2 的相关规定。 A.2 剂量检查 A.2.1 主要器材 小试管、剪刀。 A.2.2 检查方法 取三支细管冻精自然解冻后剪去两端，把精液倒入一小试管内，用 1.0 mL 吸管准确吸取精液，并 检测其精液量。 A.2.3 计算 三支冻精的剂量平均数为样品的剂量，按式(A.1)计算: Q n1  n2  n3 …………………………（A.1） 3 式中： Q ——剂量值，单位为毫升（mL） ； n1 ——第一支样品剂量，单位为毫升（mL） ； n2 ——第二支样品剂量，单位为毫升（mL） ； n3 ——第三支样品剂量，单位为毫升（mL） 。 A.3 精子活力检查 A.3.1 器材、溶液 显微镜或显微电视装置、恒温水浴箱、5.0 mL 试管、载玻片或精液性状板、盖玻片（18 mm×18 mm） 、 显微镜保温箱或恒温装置、细管剪、50 µL 移液器。 A.3.2 方法 三支细管分别直接置于 37 ℃水浴中解冻，取解冻三支混合后精液约 50 uL 置于载玻片上加盖玻片， 立即在载物台温度保持 38 ℃的情况下用 200 倍〜400 倍显微镜观察活力，也可通过电视显微装置在荧 光屏上观察活力。每样片观察 3 个视野，并应观察不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。 4 DB15/T 1769—2019 A.3.3 计算 三个视野活力评价值的平均数按式(A.2)计算： M n1  n2  n3 …………………………（A.2） 3 式中： M ——精子活力； n1 ——第一视野活力； n2 ——第二视野活力； n3 ——第三视野活力。 A.4 每剂量前进运动精子数的检查 A.4.1 主要器材 血球计数板、血色素管、1 mL 吸管、小试管、计数器、显微镜或电视显微装置、滴管、3.0 %氯化 钠溶液。 A.4.2 检查方法 细管精液用血色素管准确吸取 20 uL 解冻精液（也可使用 A.2 已检查后的样品） ，注入盛有 0.98 mL 的 3.0 %氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为 50 倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片 将计数室盖好，用小吸管吸取一滴稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流人计数室，均匀充满，不允许 有气泡或厚度过大，然后在显微镜下或电视荧光屏上观察计数。 A.4.3 计算 3 a） 每剂量中精子数=5 个中方格中的精子数×5（即计数室 25 个中方格的总精子数）×10（1 mm 内 的精子数）×1 000（每毫升精液的精子数）×50（细管稀释倍数）×剂量值。 上式可简化为： 每剂量中精子数=5 个中方格精子数×250 万(细管）×剂量值 b） 每样品观察上下两个计数室，取平均值，如两个计数室计数结果误差超过 5 %，则应重检： c） 每剂量中呈前进运动精子数按式(A.3)计算： c  s  m ……………………………（A.3） 式中： c ——每剂量中前进运动精子数，单位为个； s ——每剂量中精子数，单位为个； m ——活力，%。 A.5 精子畸形率的检查 A.5.1 器材、溶液 显微镜、载玻片、血球分类计数器、小吸管、蒸馏水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲 醛、甲醇、甘油。所用试剂为分析纯。 5 DB15/T 1769—2019 A.5.2 方法 A.5.2.1 溶液配制 A.5.2.1.1 磷酸盐缓冲液 磷酸二氢钠（NaH₂PO4·2H2O） 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 双蒸馏水定容至 100mL。 0.55 g 2.25 g A.5.2.1.2 中性福尔马林固定液 40%甲醛 HCHO（使用前每 100 mL 甲醛用 10.0 g 碳酸镁饱和后过滤） 8.0 mL 磷酸二氢钠（NaH₂PO4·2H2O) 0.55 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 2.25 g 用 0.89 %氯化钠约 50.0 mL 溶解后加入 8.0 mL 中和后的甲醛，再加 0.89 %氯化钠溶液定容至 100.0 mL。 A.5.2.1.3 姬姆萨原液 姬姆萨染料 1.0 g 甘油[C3H5(OH)3] 66.0 mL 甲醇（CH3OH） 66.0 mL 姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒人并放入恒温箱中保 温继续溶解 4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中待用，贮存时间越久染色效果越好。 A.5.2.1.4 姬姆萨染液 姬姆萨原液 磷酸盐缓冲液 蒸馏水 现配现用。 2.0 mL 3.0 mL 5.0 mL A.5.2.2 制片染色 精液解冻见 A.3,允许同时使用精子活力检查解冻的样品。 A.5.2.2.1 抹片 取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈 35°夹角，将 样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干（约 5 min)。每样品制作两个抹片。 A.5.2.2.2 固定 在已风干的抹片上滴上 1.0 mL～2.0 mL 中性福尔马林固定液，固定 15 min 后用清水缓缓冲去固定 液，吹干或自然风干。 A.5.2.2.3 染色 将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平 槽并使抹片接触染液，染色 1.5 h 后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。 6 DB15/T 1769—2019 A.5.2.3 镜检 将制备好的抹片在显微镜（400 倍～600 倍）下观察。每个抹片观察 200 个以上的精子(分左、右两 个区） ，取两片的平均值，两片的变异系数不得大于 20 %，若超过应重新制片。 A.5.2.4 计算 精子畸形率按式（A.4）计算： A1 100 ……………………………………（A.4） s