ICS 07.080 B 40 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1767—2019 代替 蒙 DB 476.1-88 马、驴冷冻精液 Frozen stallion(donkey) semen 2019-12-05 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-01-05 实施 发 布 DB15/T 1767—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替蒙DB 476.1-88《马、驴冷冻精液》。 本标准与蒙 DB 476.1-88 相比主要变化如下： ——增加了规范性引用文件(见第2章）； ——增加了检验规则(见第5章）； ——增加了标志、标签和随行文件(见第6章）； ——修改了规格与质量(1988年版的第2章；本版的第4章）； ——修改了检查方法(1984年版的第3章；本版的附录A)； ——修改了包装、运输和贮存（1984年版的第4章；本版的第7章)； ——增加了规范性附录“马驴冷冻精液质量检验方法”(见附录A)； ——增加了规范性附录“种公马驴的品种代号”(见附录B)。 本标准的附录A、附录B均为规范性附录。 本标准由内蒙古自治区畜牧工作站提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本标准主要起草单位：内蒙古自治区畜牧工作站、鄂温克旗科兴马业发展有限公司。 本标准主要起草人：阿娜尔、海龙、红海、苏雅、陈龙梅、白丹丹、高博、葛根、安乐、金伟、格 力格桑。 I DB15/T 1767—2019 马、驴冷冻精液 1 范围 本标准规定了马、驴冷冻精液的命名、技术要求、检验规则、标志、标签和随行文件、包装、运输 和贮存。 本标准适用于各品种马、驴冷冻精液产品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB/T 30396 牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输 3 技术要求 3.1 新鲜精液 色泽乳白色或淡黄色。精子活力（马≥60 %、驴≥65 %），精子密度≥6000万个/mL，精子畸形率 ≤15 %。 3.2 细管冻精外观 细管无裂痕，两端封口严密，标识清晰，信息齐全。 3.3 剂型、剂量 中型≥0.40 mL。 3.4 每剂量冻精解冻后指标 3.4.1 精子活力 马≥30 %（即≥0.30），驴≥35 %（即≥0.35）。 3.4.2 前进运动精子数 中型≥3000万个。 3.4.3 精子畸形率 马≤25 %，驴≤20 %。 3.4.4 菌落数 ≤1000 个。 1 DB15/T 1767—2019 4 检验规则 4.1 外观 用目测法。 4.2 剂量 按第 A.1 章的方法。 4.3 解冻后每剂量精液质量 解冻方法及精子活力、前进运动精子数、精子畸形率、菌落数的检验按照第 A.2 章～第 A.5 章规定 的方法。 4.4 检验分类 4.4.1 常规检验 对马、驴冷冻精液的单项目检验，是型式检验的一部分，主要是在生产的冻精入库前和售出使用时 的检验。 4.4.2 型式检验 对马、驴冷冻精液全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准，也是在生产方抽样检验、仲裁 和质量监督抽样检验时选定项的检验。 4.5 检验项目 4.5.1 常规检验 本标准中3.2和3.4.1规定。 4.5.2 型式检验 本标准中3.2～3.4规定。 4.6 判定 4.6.1 常规检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。 4.6.2 型式检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。 4.6.3 判定依据 其结果应分别符合本标准中3.2～3.4的规定。 5 标志、标签和随行文件 5.1 标志、标签 2 DB15/T 1767—2019 5.1.1 细管标记 细管冻精应在管壁上依次印刷以下内容，并且印制标识要清楚：生产站名、公畜品种、生产日期或 批次、公畜号。 5.1.2 内标签 在贮精管、灭菌纱布袋上标注马、驴个体号、品种、细管数量。 5.1.3 外标签 具体可参照 GB/T 30396 的规定执行。 5.2 随行文件 马、驴冷冻精液产品可提供的随行文件包括：系谱、检疫证明、冷冻精液检验合格证明、生产者的 生产经营许可证等。 6 包装、运输和贮存 6.1 包装 细管冷冻精液包装应在-140 ℃以下的环境中进行。将细管分类装入贮精管，包装后的细管冷冻精 液其棉塞端应朝向贮精管的底部，不得倒置。再用灭菌纱布袋将装有冷冻精液的贮精管包装起来，一个 灭菌纱布袋一个个体。 6.2 运输 细管冷冻精液运输过程中要有专人负责，贮存容器不得橫倒及碰撞和强烈振动，保证冷冻精液始终 浸在液氮中。 6.3 贮存 细管冷冻精液应浸没于液氮生物容器的液氮中。冷冻精液由一个液氮生物容器转移到另一液氮生物 容器时，在液氮生物容器外停留时间不得超过 3 s。取存冷冻精液后要及时盖好液氮生物容器塞。 具体可参照 GB/T 30396 的规定执行。 3 DB15/T 1767—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 马、驴冷冻精液质量检验方法 A.1 剂量检查 A.1.1 主要器材 小试管、剪刀、1.0 mL 吸管、捡卵仪或洗耳球、细管专用推针。 A.1.2 检查方法 取两支细管冻精自然解冻后剪去封口端，用细管专用推针把精液推入一个小试管内，用 1.0 mL 吸 管准确吸取精液，并检测其精液总量。 A.1.3 计算 两支冻精的剂量平均数为样品的剂量，按式（A.1）计算： Q=n/2 ……………………………………(A.1) 式中： Q ——剂量值，单位为毫升（mL)； N ——两支样品总剂量，单位为毫升（mL)； A.2 精子活力检查 A.2.1 主要器材 相差显微镜或相差显微系统、恒温水浴箱、5.0 mL 试管、载玻片或精液性状板、盖玻片（规格 18 mm ×18 mm）、显微镜保温箱或恒温装置、移液器。 A.2.2 检查方法 取二支细管冻精分别直接置于 37 ℃水浴中解冻 30 s，取出细管用吸水纸擦干水珠，挤入 5.0 mL 试管内混匀，用移液器取精液 10 µL 置于载玻片的一端，摇匀精液，取 10 µL 精液置于载玻片的另一端， 盖上盖玻片后立即在（200～400）倍相差显微镜下观察活力，也可通过相差显微系统在显示器上观察活 力，此时载物台温度应保持 37℃。每一样片观察盖玻片中央区域的活力，分别得出第一样片和第二样 片活力 n1 和 n2。 4 DB15/T 1767—2019 A.2.3 计算 二个视野活力评定价值的平均数按式（A.2）计算： M=(n1+n2)/2 ………………………(A.2) 式中： M ——活力； n1 ——第一样片精子活力； n2 ——第二样片精子活力。 A.3 每剂量前进运动精子数检查 A.3.1 主要器材 血球计数板、血盖片、血色素管、移液器、1 mL 吸管、小试管、计数器、显微镜或显微系统、3.0 % 氯化钠溶液。 A.3.2 检查方法 细管精液用血色素管或移液器吸取 10 µL 解冻精液（也可使用第 B.2 章已检查后的样品），注入盛 有 0.99 mL 的 3.0 %氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为 100 倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数 板用血盖片将计数室盖好，用移液器吸取 10 µL 稀释精液于血盖片边缘，使稀释精液自行流入计数室， 均匀充满，不允许有气泡，用同样方法为另一端计数室加样。静置 5 分钟后在显微镜下或显微系统显示 器上观察计数上下两个计数室各 5 个中方格的精子数，取平均值。 A.3.3 计算 a) b) 3 每剂量中精子数=5 方格中的精子数×5（即计数室 25 个方格的总精子数）×10（即 1 mm 内的 精子数）×1000（即每 mL 精液的精子数）×100（即稀释倍数）×剂量值 上式简化为： 每剂量中精子数=5 个方格中的精子数×500 万（细管）×剂量值 每剂量中呈前进运动精子数按式（A.3）计算： C=s×m …………………………（A.3） 式中： C ——每剂量中前进运动精子数，单位为个； S ——每剂量中精子数，单位为个； m ——活力，%； A.4 精子畸形率的检查 A.4.1 主要器材 显微镜、载玻片、血球分类计数器、移液枪、蒸馏水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲 醛、甲醇、甘油、伊红苯胺黑染液等所用试剂为分析纯。 5 DB15/T 1767—2019 A.4.2 试剂配制 A.4.2.1 磷酸盐缓冲液 磷酸二氢钠（NaH2PO4 .2H2O) 磷酸氢二钠（NaHPO4 .12H2O) 双蒸馏水定容至 100 mL。 0.55 g 2.25 g A.4.2.2 中性福尔马林固定液 40%甲醛 HCHO（使用前经碳酸镁中和过滤） 8.0 mL 磷酸二氢钠（NaH2PO4 .2H2O) 0.55 g 磷酸氢二钠（NaHPO4 . 12H2O) 0.25 g 用 0.89%氯化钠约 50.0 mL 溶解后加入 8.0 mL 中和后的甲醛，再加 0.89 %氯化钠溶液定容至 100.0 mL。 A.4.2.3 姬姆萨原液 姬姆萨染料 10.0 g 甘油【CH5（CH）3】 66.0 mL 甲醇（CH3OH) 66.0 mL 姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒入并放入恒温箱中保 温继续溶解 4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中代用，贮存时间越久染色效果越好。 A.4.2.4 姬姆萨染液 姬姆萨原液 2.0 mL 磷酸盐缓冲液 3.0 mL 蒸馏水 5.0 mL 现配现用。也可购买商品化的姬姆萨染液，按产品说明使用。 A.4.2.5 伊红苯胺黑染液 伊红 Y（颜色指数 45380）染料 3.3 g 苯胺黑染料 20.0 g 柠檬酸钠 1.5 g 蒸馏水 300.0 mL 将苯胺黑染料加入蒸馏水中，边搅拌边加热，直至完全溶解，然后加入伊红染料，边搅拌边加热， 溶解过程中要避免沸腾。调整 pH 值至 6.8～7.0，染液保存数天后进行过滤，储存于暗色密封的玻璃瓶 中待用，在常温下，保存期 6 个月左右。也可购买商品化的伊红苯胺黑染液，按产品说明使用。 A.4.3 制片、染色、镜检、计算 精液解冻见 A.2，允许同时使用精子活力检查解冻的样品。 6 DB15/T 1767—2019 A.4.3.1 抹片染色法 抹片：取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈 35°夹 角，将样品均匀