ICS 11.220 DB37 B 42 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3712—2019 公英青蓝合剂中添加金刚乙胺的测定 超高效液相色谱-串联质谱法 Determination addition of rimantadine in gongyingqinglan mixture—UPLC-MS/MS 2019 - 11 - 18 发布 山东省市场监督管理局 2019 - 12 - 18 实施 发 布 DB37/T 3712—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 原理 ............................................................................... 1 4 试剂或材料 ......................................................................... 1 5 仪器设备 ........................................................................... 1 6 试验步骤 ........................................................................... 2 6.1 6.2 6.3 6.4 样品溶液的制备 ................................................................. 基质匹配对照溶液的制备 ......................................................... 仪器参考条件 ................................................................... 测定 ........................................................................... 2 2 2 3 7 试验数据处理 ....................................................................... 3 8 精密度 ............................................................................. 3 附 录 A （资料性附录） 金刚乙胺特征离子质量色谱图 .................................. 4 I DB37/T 3712—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省兽药质量检验所。 本标准主要起草人：张传津、魏秀丽、李有志、陈玲、张志民、赵有轩、张呈军、章安源、尹伶灵。 II DB37/T 3712—2019 公英青蓝合剂中添加金刚乙胺的测定 法 超高效液相色谱-串联质谱 1 范围 本标准规定了公英青蓝合剂中金刚乙胺的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于公英青蓝合剂中金刚乙胺的测定。 本方法检测限为2 μg/mL，定量限为5 μg/mL。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 公英青蓝合剂中的金刚乙胺经稀释后，超高效液相色谱串联质谱测定，依据保留时间和离子丰度比 定性，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯；水符合GB/T 6682一级水的规定。 4.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 4.2 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 4.3 流动相： a) 流动相 A 甲醇(含 0.1 %甲酸)：吸取甲酸（4.2）1.0 mL，加甲醇（4.1）稀释至 1 000 mL， 过 0.22 μm 微孔滤膜备用； b) 流动相 B 水溶液（含 0.1 %甲酸）：吸取甲酸（4.2）1.0 mL，加水稀释至 1 000 mL，过 0.22 μm 微孔滤膜备用； c) 初始比例流动相：量取甲醇（含 0.1 %甲酸） （4.3.1）100 mL 与水溶液（含 0.1 %甲酸）（4.3.2） 400 mL，混匀，备用。 4.4 金刚乙胺对照品，纯度不得小于 99.9 %。 4.5 金刚乙胺对照储备液：称取金刚乙胺对照品（4.4）10 mg（准确至 0.01 mg），置 100 mL 容 量瓶中，加甲醇（4.1）溶解并稀释至刻度，摇匀。4 ℃冰箱保存，有效期 3 个月。 4.6 有机微孔滤膜：0.22 μm。 5 仪器设备 1 DB37/T 3712—2019 5.1 高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。 5.2 分析天平：感量 0.000 01 g。 5.3 离心机（5 000 r/min）。 6 试验步骤 6.1 样品溶液的制备 公英青蓝合剂摇匀，精密吸取空白公英青蓝合剂0.2 mL，置50 mL离心管中，加19.8 mL甲醇（4.1）， 超声处理10 min，5 000 r/min离心5 min，有机微孔滤膜过滤，精密量取滤液1 mL，置50 mL容量瓶中 加初始流动相（4.3.3）稀释至刻度，摇匀，有机微孔滤膜滤过，即得空白基质溶质。待测样品以上法 处理，得供试样品溶液。 6.2 基质匹配对照溶液的制备 精密吸取金刚乙胺对照储备液（4.5）0.2 mL，置20 mL容量瓶中，加空白基质溶液（6.1）稀释至 刻度，摇匀，从中精密量取1 mL置50 mL容量瓶中，加空白基质溶液（6.1）稀释至刻度，摇匀，滤过， 即得20 ng/ml的对照溶液。 6.3 仪器参考条件 6.3.1 高效液相色谱参考条件 色谱柱：C18色谱柱，50 mm×2.1 mm×1.7 μm，或性能相当者。 流动相A：甲醇（含0.1 %甲酸）。 流动相B：水溶液（含0.1 %甲酸）。 流速：0.3 mL/min。 进样量：10 μL。 柱温：35 ℃。 液相色谱梯度洗脱条件见表1。 表1 液相色谱梯度洗脱条件 -1 时间/min 流速/(mL·min ) 流动相 A/% 流动相 B/% 曲线 0 0.3 20 80 0.5 0.3 20 80 6 2.0 0.3 80 20 6 3.0 0.3 80 20 6 4 0.3 20 80 1 5 0.3 20 80 6.3.2 质谱参考条件 + 电离模式：电喷雾正离子（ESI ）。 毛细管电压：3 kv。 离子源温度：110 ℃。 脱溶剂温度：320 ℃。 2 DB37/T 3712—2019 脱溶剂氮气流速：550 L/h。 检测方式：多反应监测（MRM）。 金刚乙胺的定性、定量离子对和碰撞能量见表2。 表2 定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量 品名 定量离子对 定性离子对 金刚乙胺 180.6＞163.2 180.6＞163.2 180.6＞107.2 锥孔电压/V 20 碰撞能量/eV 20 30 6.4 测定 6.4.1 定性测定 通过样品溶液色谱图的保留时间与相应对照溶液的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应对照溶液 各色谱峰的特征离子相对照定性。样品溶液与对照溶液保留时间的相对偏差不大于2.5 %；样品溶液特 征离子的相对离子丰度与对照溶液的相对离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表3的规定，则可判 断样品中存在金刚乙胺。 表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50 % ＞20 %至 50 % ＞10 %至 20 % ≤10 % 允许的相对偏差 ±20 % ±25 % ±30 % ±50 % 6.4.2 定量测定 取样品溶液和对照溶液各10 μL注入液相色谱－串联质谱仪，在上述色谱-质谱条件下进行测定， 记录质量色谱图，外标法定量。典型的金刚乙胺对照溶液中特征离子的质量色谱图参见附录A。 7 试验数据处理 样品中金刚乙胺的含量按下式计算： X = CV1 /1000V ..................................... (1) 式中： X ──试样中金刚乙胺的含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）； C ──试样溶液中金刚乙胺浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V1 ──试样溶液总体积（按6.1描述为1 000），单位为毫升（mL）； V ──试样的取样量，单位为毫升（mL）。 8 精密度 在重复性条件下两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。 3 DB37/T 3712—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 金刚乙胺特征离子质量色谱图 Jgya00003 MRM of 2 Channels ES+ 180.6 > 163.2 (JGYA) 2.62e5 Area 2.78 23267 % 100 3.69 74 0 Jgya00003 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 MRM of 2 Channels ES+ 180.6 > 107.2 (JGYA) 3.04e4 Area 3.00 3.50 4.00 2.78 2650 % 100 0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 4.50 Time 5.00 图A.1 20 ng/mL 金刚乙胺对照溶液特征离子质量色谱图 Jgya00010 MRM of 2 Channels ES+ 180.6 > 163.2 (JGYA) 2.28e5 Area 2.78 2008