ICS 65.020.01 B 16 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3681—2019 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术 规范 Technical specification for molecular typing of toxin-producing fusarium species in wheat 2019 - 12 - 04 发布 江苏省市场监督管理局 2019 - 12 - 25 实施 发 布 DB32/T 3681—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：邢宇俊、仇剑波、董飞、徐剑宏、史建荣、吴季荣、陆丹丹。 I DB32/T 3681—2019 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范 1 范围 本标准规定了小麦产毒镰刀菌种群以及产毒素化学型区分中镰刀菌DNA的提取、PCR扩增、电泳 检测及结果判定方法和操作规范。 本标准适用于产毒镰刀菌种群及产毒化学类型的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.15 食品安全国家标准 食品微生物检验 霉菌和酵母计数 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 产毒镰刀菌经过提取 DNA 后，利用特异性区分引物，通过普通 PCR 判断该样品是否为禾谷镰刀 菌或亚洲镰刀菌。根据关键特异基因 Tri11 来区分该样品是否产生 3ADON、15ADON 或者雪腐镰刀烯 醇 NIV 化学型。 4 试剂和材料 4.1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 PDA 培养基：按 GB4789.15 规定。 4.3 CTAB 缓冲液:55 mmol/L CTAB、1400 mmol/L 氯化钠（NaCl）、20 mmol/LEDTA、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），121℃高压灭菌 20 min，储存于 2℃～8℃。 4.4 TE 缓冲液。 4.5 RNA 酶溶液（5μg/μL）。 4.6 蛋白酶 K（20mg/mL）。 4.7 Tri 饱和酚。 4.8 酚：三氯甲烷：异丙醇（25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇（24：1）。 4.9 异丙醇。 4.10 区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌引物 Fg16F: 5′-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3′ Fg16R: 5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′ 预期亚洲镰刀菌扩增片段大小为 497 bp；预期禾谷镰刀菌扩增片段大小为 410 bp。 4.11 区分 3A-DON、5A-DON 和 NIV 化学型引物 1 DB32/T 3681—2019 Tri11-CON: 5′-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3′ Tri11-3ADON: 5′-TCCTCATGCTCG GTGGACTCG-3′ Tri11-15ADON: 5′-TGGTCCAGT TGTCCGTATT-3′ Tri11-NIV: 5′-GTAGGTTCCATTGC TTGTTC-3′ 预期产 3ADON 毒素类型扩增片段大小为 334 bp； 产 15ADON 毒素类型扩增片段大小为 279bp ； 产 NIV 毒素类型扩增片段大小为 497 bp。 4.12 无水乙醇。 4.13 DNA Ladder：可以清楚区分 100 bp～1000 bp 的 DNA 片段。 4.14 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液 等体积混合。 4.15 Taq DNA 聚合酶、PCR 扩增缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。 4.16 50×TAE 缓冲液：称取 484g Tris，量取 114 mL 冰乙酸，200mL 0.5 mol/L EDTA，溶于水中，定 容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用时用水稀释成 1×TAE 电泳缓冲液（工作液）。 4.17 加样缓冲液。 4.18 琼脂糖。 4.19 溴化乙锭。 5 主要仪器和设备 5.1 5.2 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg。 PCR 扩增仪：升降温速度>1.5 ℃/s，孔间温度差异<1.0 ℃。 电泳槽、电泳仪等电泳装置。 紫外透射仪。 凝胶成像系统或照相系统。 高速冷冻离心机：转速不低于 12000 r/min。 培养箱。 6 检测 6.1 样品制备与培养 参照 GB 4789.15 对样品进行稀释与培养。 6.2 DNA 提取 从培养平皿上刮取菌丝 0.2 g~0.5 g 于 1.5 mL 灭菌离心管中，加入少许石英砂用细玻璃棒充分碾碎 菌丝，加入 500 μL CTAB、40 μL 蛋白酶 K，震荡均匀，65°C 水浴 30min；加入 500 μL 酚：三氯甲烷： 异戊醇（25：24：1），强烈震荡，12000r/min 离心 15 min；吸取上层水相至 1.5 mL 离心管中，加入等 体积的异丙醇，震荡混匀，12000r/min 离心 15 min；弃上清液，用预热至 65°C TE 缓冲液溶解 DNA（TE 量视 DNA 沉淀的多少而定）；加入 5 μL RNA 酶溶液，37°C 水浴 30 min；加入 200 μL 三氯甲烷：异 戊醇（24：1），强烈震荡，12000r/min 离心 15 min；吸取上层水相至新的 1.5 mL 离心管中，加入等体 积的异丙醇，震荡均匀，12000r/min 离心 10 min；弃上清液，加入 1 mL70%冰乙醇洗涤沉淀 DNA， 12000r/min 离心 10 min；弃上清液，无菌条件下自然干燥，加预热至 65°C TE 缓冲液溶解 DNA（如不 能及时检验，可将提取液于-20°C 保存） 2 DB32/T 3681—2019 也可使用等效的真菌基因组 DNA 提取试剂盒。 6.3 PCR 检测 6.3.1 区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌检测 6.3.1.1 PCR 反应体系 在 PCR 管中按表 1 依次加入反应试剂，混匀。也可采用经验证的、等效的定性 PCR 试剂盒配制反 应体系。 表 1 PCR 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 — 水 10×PCR 缓冲液 1× 2.5 µL 1.5 mmol/L 1.5 µL 各 0.2 mmol/L 2.0 µL 10 µmol/L Fg16F 0.3 µmol/L 0.75 µL 10 µmol/L Fg16R 0.3 µmol/L 0.75 µL Taq DNA 聚合酶 0.025 U/µL — 2 mg/L 2.0 µL 25 mmol/L 氯化镁溶液 dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L） 25 mg/L DNA 模板 总体积 25.0 µL “—”表示体积不确定，如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据 Taq DNA 聚合酶的浓度确定其 体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 µL。 6.3.1.2 PCR 反应程序 反应程序为：94 ℃变性 5 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共进行 35 次循 环；72 ℃延伸 10 min。 不同仪器、不同 Taq DNA 聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 6.3.1.3 PCR 结果检测 用电泳缓冲液（1×TAE）制备 2%琼脂糖凝胶（55℃~60℃时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5 µg/ml， 也可在电泳后进行染色） 。取 8 µL~15 µL PCR 扩增产物，加入 2 µL 上样缓冲液混合，进行点样，用 DNA Ladder 作参照，9 v/cm 恒压电泳，电泳 40 min~60 min，电泳结束后，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪 上成像。根据 DNA 分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。 在样品 PCR 扩增的同时，应设置 PCR 阴性对照、PCR 阳性对照和 PCR 空白对照，实验重复三次。 6.3.2 3ADON、15ADON 和 NIV 化学型检测 6.3.2.1 PCR 反应体系 在 PCR 管中按表 2 依次加入反应试剂，混匀。也可采用经验证的、等效的定性 PCR 试剂盒配制反应体 系。 3 DB32/T 3681—2019 表 2 PCR 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 — 水 10×PCR 缓冲液 1× 2.5 µL 1.5 mmol/L 1.5 µL 各 0.2 mmol/L 2.0 µL 10 µmol/L Tri11-CON 0.3 µmol/L 0.75 µL 10 µmol/L Tri11-3ADON 0.3 µmol/L 0.75 µL 10 µmol/L Tri11-15ADON 0.3 µmol/L 0.75 µL 10 µmol/L Tri11-NIV 0.3 µmol/L 0.75 µL Taq DNA 聚合酶 0.025 U/µL — 2 mg/L 2.0 µL 25 mmol/L 氯化镁溶液 dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L） 25 mg/L DNA 模板 总体积 10 µmol/L 25.0 µL “—”表示体积不确定，如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据 Taq DNA 聚合酶的浓度 确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 µL。 6.3.2.2 PCR 反应程序 反应程序为：94 ℃变性 5 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共进行 35 次循 环；72 ℃延伸 10 min。 不同仪器、不同 Taq DNA 聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 6.3.2.3 PCR 结果检测 用电泳缓冲液（1×TAE）制备 2%琼脂糖凝胶（55℃~60℃时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5 µg/mL， 也可在电泳后进行染色） 。取 8 µL~15 µL PCR 扩增产物，加入 2µL 上样缓冲液混合，进行点样，用 DNA Ladder 作参照，9 v/cm 恒压电泳，电泳 40 min~60 min，电泳结束后，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪 上成像。根据 DNA 分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果