ICS 65.020.20 B 16 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3680—2019 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 The detection of pathogen for Maize Rough Dwarf disease by dot immuobinding assay method 2019 - 12 - 04 发布 江苏省市场监督管理局 2019 - 12 - 25 实施 发 布 DB32/T 3680—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：周彤、杜琳琳、周益军、孙枫、兰莹、李硕、范永坚。 I DB32/T 3680—2019 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 1 范围 本标准规定了大麦、小麦、玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法。 本标准适用于大麦、小麦、玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原的检测。 2 斑点酶联免疫吸附检测原理 硝酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。将抗原吸 附于硝酸纤维素膜后，可利用膜作为固相载体进行抗原抗体反应。当加入抗原的特异性抗体后，即可与 膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的二抗，使酶标记通过二抗和相应抗体的结合间接地交联于纤 维素膜上。最后加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色。 3 仪器设备与试剂材料 3.1 仪器设备 台式离心机（5 000 r/min）；具盖塑料离心管：200 µL；培养皿（直径为90 mm）；塑料盒（规格 为100 mm×50 mm）。 3.2 试剂材料 3.2.1 试验用水均为蒸馏水，使用的化学试剂未作说明均为分析纯级别。 3.2.2 包被缓冲液：0.05 mol/L，pH值9.6。称取 1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHCO3，加水定容至1 000 mL， 用HCl调pH值至9.6，4℃保存。 3.2.3 磷酸盐Tween 20缓冲液（0.01M PBST）：0.01mol/L，pH=7.5。称取40 g NaCl, 1 g KCl, 1 g KH2PO4 和15 g Na2HPO4，加水定容至5 000 mL，用HCl调节pH值至7.5，再加入2.5 mLTween 20，4℃保存。 3.2.4 磷酸盐缓冲液（0.02M PBS）：0.02 mol/L，pH值7.5。称取40 g NaCl，1 g KCl，1 g KH2PO4， 15 g Na2HPO4，加水定容至2 500 mL，4℃保存。 3.2.5 1%脱脂奶粉封闭液：1 g脱脂奶粉加入100 mL磷酸盐Tween20缓冲液中，4℃保存。 3.2.6 辣根过氧化物酶固体显色底物溶液：6 mg的4-氯-1-萘酚加入2 mL无水乙醇中，4℃保存备用，使 用时加入10 mL 磷酸盐缓冲液中，再加入10 µL H2O2。 3.2.7 BCIP/NBT显色底物：碱性磷酸酶底物显色试剂盒。 3.2.8 单克隆抗体（单抗）：玉米粗缩病病原RBSDV单克隆抗体，效价为1:5 000～1:10 000，－20℃保 存。 3.2.9 酶标二抗：Goat Anti-Mouse IgG Antibody，HRP（检测灰飞虱），Goat Anti-Mouse IgG Antibody, AP（检测植物），－20℃保存。 4 植物样品检测 1 DB32/T 3680—2019 4.1 样品制备 4.1.1 田间采集新鲜的大麦、小麦、玉米植株的茎秆或叶片，装至无菌样品袋中。标记样品编号、取样 时间、取样地点，48 h内送至实验室，放置-20℃冰箱保存备用，避免反复冻融。 4.1.2 取0.5 mg大麦、小麦或玉米的茎秆或叶片研磨成粉末，碳酸盐包被液稀释100倍，离心（5 000 r/min） 3 min，取上清液备用。 4.2 封闭 4.2.1 预先用铅笔将硝酸纤维素膜（NC膜）划成5 mm×5 mm的正方格，取2.0 µL 4.1获得的上清液点于 NC膜上正方格中心（以不超出正方格一半为准）；同时取2.0 µL已采用本方法测定为感染玉米粗缩病 的玉米汁液点于膜上预先标记好的正方格内，作为阳性对照，取2.0 µL已采用本方法测定为不感染玉米 粗缩病的玉米汁液点于膜上预先标记好的正方格内，作为阴性对照，将膜置于室温晾干。 4.2.2 将干燥的膜置于塑料盒或玻璃培养皿，加入1%脱脂奶粉封闭液，要求将膜完全浸没，37℃轻轻摇 晃，封闭30 min。 4.3 孵育 4.3.1 用镊子压住膜倒弃封闭液，将单抗和1%脱脂奶粉封闭液按1:5 000～1:10 000比例稀释配制孵育液， 将膜完全浸入孵育液，37℃轻轻摇晃，孵育1 h～1.5 h。 4.3.2 用镊子压住膜倒弃孵育液，加入磷酸盐Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜3 min～5 min，用镊子压住膜倒弃洗液，重复洗膜三次。 4.4 二抗孵育 4.4.1 用镊子压住膜倒弃洗液，将二抗（Goat Anti-Mouse IgG Antibody, AP）和封闭液按1:5 000比例稀 释配制孵育液，将膜完全浸入二抗孵育液，37℃轻轻摇晃，孵育1.5 h～2 h，再用镊子压住膜倒弃二抗 孵育液。 4.4.2 加入磷酸盐Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜3 min～5 min，用镊子压住膜倒弃洗 液，重复洗膜三次。 4.5 显色 用镊子压住膜倒弃洗液，加入BCIP/NBT显色底物溶液，37℃静置显色30 min；蒸馏水冲洗膜，室 温晾干。 4.6 结果判定 显色后首先观察对照的颜色反应，阳性对照应显蓝紫色，阴性对照应不显色，再观察样品的颜色反 应，如果显蓝紫色，则认定植株感染了玉米粗缩病，如果不显色，则认定未感染玉米粗缩病。试验结果 记载表见附录A。 5 灰飞虱带毒率检测 5.1 样品制备 5.1.1 采集灰飞虱高龄若虫或成虫，虫量不少于100头，装至塑料瓶中。样品储存方法同4.1.1。 5.1.2 单头灰飞虱置于离心管中，加100 µL碳酸盐包被缓冲液，用牙签捣烂，离心（5 000 r/min）3 min， 取灰飞虱提取液备用。 2 DB32/T 3680—2019 5.2 封闭 同4.2。取2.0 µL已采用本方法测定为带毒的灰飞虱提取液作为阳性对照，取2.0 µL已采用本方法测 定不带毒的灰飞虱提取液，作为阴性对照。 5.3 孵育 同4.3。 5.4 二抗孵育 同4.4。二抗选Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP。 5.5 显色 用镊子压住膜倒弃洗液，加入辣根过氧化物酶固体显色底物溶液，37℃静置显色30 min；蒸馏水冲 洗膜，室温晾干。 5.6 结果判定 5.6.1 灰飞虱带毒判定 同4.6。 5.6.2 带毒率计算 按照公式1计算灰飞虱带毒率，结果保留到小数点后一位。试验结果记载表见附录B。 Lc  Nc Nt  100 …………………………………………………………公式1 式中：Lc—灰飞虱带毒率，单位为百分率（%）； Nc—带毒灰飞虱虫量； Nt—测定灰飞虱总虫量。 3 DB32/T 3680—2019 附录 A （规范性附录） 植物样品检测结果记录表 植物样品检测结果记录表A.1。 表 A.1 植物样品检测结果记录表 样品采集日期 样品采集地点 测定样品数量 阳性样品数 阴性样品数 鉴定技术负责 （株） （株） （株） 人 4 DB32/T 3680—2019 附录 B （规范性附录） 灰飞虱带毒率测定结果记录表 灰飞虱带毒率测定记录表B.1。 表 B.1 灰飞虱带毒率测定结果记录表 灰飞虱采 灰飞虱采集 灰飞虱代 测定样品数量 阳性样品数 阴性样品数 带毒率 鉴定技术 集日期 地点 次 （头） （头） （头） （%） 负责人 _________________________________ 5