ICS 65.020.30 B 40 江 DB32 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3686—2019 山羊副流感病毒 3 型检测技术规程 Technical regulations for detection of Caprine parainfluenza virus 3 2019 -12-04 发布 2019-12-25 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3686—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：李文良、毛立、李基棕、郝飞、刘茂军、杨蕾蕾、孙敏。 I DB32/T 3686—2019 山羊副流感病毒 3 型检测技术规程 1 范围 本标准规定了山羊副流感病毒3型（Caprine paraifluenza virus 3, CPIV3）的病原学检测（病毒核酸 的RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测）、血清学检测（血凝抑制（HI）试验）的技术要求。 本标准适用于山羊副流感病毒3型及其感染情况的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 病原学检测 3.1 材料 微量移液器及吸头、DEPC水处理的离心管、吸头、PCR扩增管、TRIzol试剂、三氯甲烷、异丙醇、 DEPC处理水（用水符合GB/T 6682规定）、反转录酶/Taq DNA聚合酶混合液、2×一步法RT-PCR反应缓 冲液、一步法荧光定量RT-PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、引物MF/MR、引物qMF/qMR 与探针（附录A）。 3.2 仪器设备 PCR 仪、荧光定量 PCR 仪、台式冷冻离心机、电泳仪和水平电泳槽、凝胶成相仪（或紫外透射仪） 。 3.3 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 3.3.1 样品处理与 RNA 的提取 采集羊的鼻拭子、气管拭子或肺脏（样品的采集、保存和运输应符合NY/T 541相关规定）。取200 μL待检样品液至无菌无RNA酶的EP管中，使用TRIzol试剂、RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等方 法提取RNA。 3.3.2 RT-PCR 反应 RT-PCR反应使用20 μL体系：10 μL 2×一步法RT-PCR反应缓冲液、引物MF/MR各0.5 μL（10 μmol/L）、0.4 μL反转录酶/Taq DNA聚合酶混合液、4 μL RNA模板，4.6 μL DEPC处理水。反应条件为： 45 ℃反转录30 min；94 ℃ 预变性2 min；94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。 3.3.3 结果判定 取PCR产物10 μL，在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。样品PCR检测产 物电泳后有大小为346 bp的片段判断为山羊副流感病毒3型核酸阳性，无条带判断为阴性。每次试验应 设置阴阳性对照，阴阳性对照应不出现或出现相应大小的条带。 1 DB32/T 3686—2019 3.4 荧光定量反转录-聚合酶链式反应（荧光定量 RT-PCR） 3.4.1 核酸提取与荧光定量RT-PCR反应 核酸提取同3.3.1。荧光定量RT-PCR反应使用20 μL体系：10 μL 2×一步法反应缓冲液，0.4 μL反转 录酶，0.4 μL DNA聚合酶，引物qMF/qMR各0.4 μL（10 μmol/L），0.8μL探针，0.4μL染料，2 μL RNA 模板，5.2 μL DEPC处理水。将PCR管置于荧光定量PCR仪器上进行RT-PCR扩增，程序如下：42 ℃ 5 min； 95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃34 s，共进行40个循环。 3.4.2 荧光定量RT-PCR结果判定 阳性对照扩增曲线呈标准的S曲线，且Ct值＜30。阴性对照扩增曲线应为基线下的水平线。若样本 曲线呈S形曲线，且Ct值＜38为阳性；未出现扩增曲线为阴性。 4 血清学检测——血凝抑制（HI）试验 4.1 材料 微量移液器及配套吸头、96孔V型微量反应板、生理盐水、1%豚鼠红细胞悬液（配制方法见附录B）、 病毒液（相关试验操作应符合GB 19489的要求）、标准阳性血清、标准阴性血清。 4.2 仪器设备 离心机、恒温培养箱。 4.3 病毒血凝效价测定 每次HI试验前应对病毒血凝效价进行测定，检测与判定方法如下： ——在反应板一排各孔中加25 μL 生理盐水； ——第一孔中加25 μL病毒分离液，按照1:2倍比稀释，最后一孔不加抗原作阴性对照。每孔中再加 25 μL PBS； ——每孔加25 μL 1%豚鼠红细胞液，37 ℃孵育40 min； ——当红细胞被凝集时，红细胞均匀分布在反应板底部，反应板倾斜片刻，红细胞不下滑；红细胞 未被凝集时，反应板倾斜片刻，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线。HA效价为全部红细 胞出现凝集时的最高稀释倍数。 4.4 HI 试验 按如下方法进行 HI 试验： ——在 96 孔 V 型微量反应板各孔中加 25 μL 生理盐水； ——加 25 μL 经处理的血清于第一孔中，混匀后取 25 μL 加到第 2 孔中，依次倍比稀释，从第 2 孔 加至第 11 孔，第 11 孔混匀后吸取 25 μL 弃去，最后 1 孔不加血清作为对照； ——每孔中加 25 μL 4 个 HA 单位的病毒抗原，37 ℃孵育 40 min； ——每孔加 25 μL 1%豚鼠红细胞液，37 ℃孵育 40 min。 4.5 结果判定 将反应板倾斜70度左右，若无凝集反应，则沉淀的红细胞向下滑动，呈流线状，记录为抗体阳性。 完全抑制凝集的抗体最高稀释倍数为血清的HI抗体滴度。 抗体滴度大于等于16为阳性，小于等于8为阴性。若检测发病后双份血清（第一份血清应在临床症 状出现后立即采集，第二份血清在两周后采集），抗体滴度上升4倍或4倍以上时，表明羊只近期被感染。 2 DB32/T 3686—2019 附录 A （资料性附录） 引物 A.1 引物序列 表A.1 用于RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测的引物、探针 引物 靶基因 序列（5’-3’） MF M 基因 AGTGATCTAGATGATGATCCA MR M 基因 GTTATTGATCCAATTGCTGT qMF M 基因 GCTTGGCTTCTTTGAAATGG qMR M 基因 GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC CPIV3 Probe M 基因 FAM-CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGG GA-TAMRA 产物 346bp 150bp A.2 引物的溶解 引物MF、MR、qMF、qMR用灭菌的DEPC处理水溶解到浓度为10 µmol/L；CPIV3 Probe用灭菌的 DEPC处理水溶解到浓度为10 µmol/L。 3 DB32/T 3686—2019 附录 B （资料性附录） 1%豚鼠红细胞的配制 B.1 生理盐水配制方法 氯化钠（NaCl） 0.9 g 去离子水加至100 mL，121 ℃高压灭菌15 min，冷却后保存于2℃～8 ℃冰箱中备用。 B.2 1%豚鼠细胞悬液制备 无菌采集豚鼠血液，置于EDTA抗凝管中混匀，2℃～8 ℃保存。使用前吸取红细胞悬液置离心管中， 加入生理盐水洗涤3次，每次以2000 r/min离心5 min，将血浆、白细胞等充分洗去，沉积的红细胞用生 理盐水稀释成1%的悬液，保存于2 ℃～8 ℃冰箱中备用。 ─────────── 4