ICS 65.020.30 B 43 DB14 山 西 省 地 方 标 准 DB 14/ T 1518—2017 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法 2017 - 12 - 10 发布 山西省质量技术监督局 2018 - 02 - 10 实施 发 布 DB14/ T 1518—2017 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 2 5 试验准备 .......................................................................... 2 6 步骤 .............................................................................. 2 7 判定依据 .......................................................................... 3 8 结果表述 .......................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 溶液配制说明 ............................................ 4 附录 B（资料性附录） FAO-ISAG 推荐引物信息表 ................................. 7 附录 C（资料性附录） 样品 DNA 的制备及质控检测 ................................ 8 附录 D（资料性附录） PCR 反应体系及程序 ....................................... 10 附录 E（资料性附录） 扩增产物的银染检测方法 ................................... 11 附录 F（资料性附录） 数据分析指标及公式 ....................................... 13 DB14/ T 1518—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山西农业大学提出并归口。 本标准起草单位：山西农业大学、中国农业大学、大同市种猪场、山西省畜禽繁育工作站、山西天 合元动物保健科技有限公司。 本标准主要起草人：高鹏飞、郭晓红、曹果清、李步高、刘剑锋、杨连仲、王效京、刘宏、孙秉耀、 石建中、赵万军。 II DB14/ T 1518—2017 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用SSR标记法进行晋汾白猪品种鉴定的原理、试验准备、步骤、判定依据和结果表 述。 本标准适用于晋汾白猪种质分子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 NY/T 1673 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范。 DB14/T 1300 晋汾白猪 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SSR 标记 SSR标记，即简单重复序列（Simple Sequence Repeats, SSR），又称微卫星DNA，由核心序列和两 侧的侧翼序列组成，侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体上，核心序列重复数的差异形成微卫星高度 的多态性。 3.2 参照样品 对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。 3.3 位点 对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。 3.4 核心位点 1 DB14/ T 1518—2017 DNA分子标记法鉴定品种时优先选用的一组位点，具有多态性高、稳定性强、重复性好、分布均匀 等特点。 3.5 扩展位点 DNA分子标记法鉴定品种时备选的一组位点，具有重复性好，分布均匀的特点。 4 原理 根据SSR侧翼序列设计一对特异引物，利用PCR技术扩增目的片段，由于不同个体SSR重复数不等， 电泳后不同长度的PCR产物得以分离，经硝酸银染色加以区分。 5 试验准备 5.1 实验仪器设备 凝胶成像系统、PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、稳压温流电泳仪、高压灭菌器、单道 可调移液器(2 μl，10 μl，20 μl，100 μl，200 μl，1000 μl)、微量电子天平、水浴恒温震荡器、电 泳槽、普通离心机、紫外检测仪、超纯水仪。 5.2 试验所用试剂 血液裂解液、组织DNA提取液和精子裂解液、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、溴化乙锭、 10×TBE或TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、100 bp DNA分子量标记、冰乙酸、琼脂糖、RNA酶、蛋白酶K、 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硝酸银、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、无水碳酸钠、 dNTPs、Tap DNA聚合酶、超纯水。 5.3 溶液配置 溶液配置方法见附录A，除另外说明外，附录A中仅使用确认为分析纯的试剂。 6 步骤 6.1 样品采集 6.1.1 对于动物样品的采集与保存按照 SN/T 2123 的规定执行。 6.1.2 采集个体应具备晋汾白猪品种的典型特征，符合 DB14/T 1300 的要求，采集三代内无血缘关系 的个体不少于 30 头，其中雌性数量不少于 1/3。 6.1.3 样品采集时应详细记录材料名称、来源、系谱、采集地点和时间、样品保存条件。 6.2 样品 DNA 提取 样品DNA的制备方法参见附录B。 6.3 引物合成 2 DB14/ T 1518—2017 使用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的用于畜禽微卫星DNA遗传检测的标记 30对，引物序列参见附录C。引物合成委托生物公司合成。 6.4 DNA 微卫星位点的扩增及检测 6.4.1 采用 PCR 方法扩增所选微卫星引物的目的片段。 6.4.2 PCR 反应体系及程序参见附录 D。 6.4.3 扩增产物的检测方法参见附录 E。 6.5 基因分型 6.5.1 利用凝胶成像分析系统进行分析，根据分子量标记物的大小标定检测片段的大小。 6.5.2 扩增片段要求条带清晰；纯合子为一条带，杂合子为两条带，且两条带着色深浅基本一致。 6.5.3 根据片段大小确定等位基因型。 6.6 数据统计分析 6.6.1 数据统计分析等位基因频率、哈代-温伯格平衡、遗传杂合度、多态信息含量、基因分化系数、 Nei 氏遗传距离，具体算法公式参见附录 F。 6.6.2 应用 GENEPOP 软件进行数据分析并进行聚类分析，采用 Bootstrap 检验可检验所得系统发生树 的可靠性。 7 判定依据 7.1 7.2 7.3 7.4 品种间差异位点数≧3，判定为不同品种。 品种间差异位点数=2 或 1，判定为近似品种。 品种间差异位点数=0，判定为疑同品种。 对 7.1 和 7.2 的结果，结合表型检测数据进行综合判定。 8 结果表述 检测位点数为 ，差异位点数为 （相同或相近、不同）。 ，判定为遗传相似度为 ，位点缺失率为 ，判定为 3 DB14/ T 1518—2017 附 录 A （规范性附录） 溶液配制说明 A.1 DNA提取试剂的配制 A.1.1 血液裂解液 血液裂解液配制见表A.1。 表A.1 血液裂解液的配制 贮存液浓度 体积(mL) 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0） 1 10 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 100 mmol/L 10 %SDS 20 2% 灭菌双蒸水加至 100 — A.1.2 组织DNA提取液 组织DNA提取液配制见表A.2。 表A.2 组织 DNA 提取液的配制 贮存液浓度 体积（mL） 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0） 5 50 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 100 mmol/L 0.5 mol/L NaCl 20 100 mmol/L 10 %SDS 20 2 % 灭菌双蒸水加至 100 — A.1.3 精子裂解液 精子裂解液配制见表A.3。 表A.3 精子裂解液的配制 贮存液浓度 体积(mL) 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0） 1 10 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 2 10 mmol/L 0.5 mol/L NaCl 20 100 mmol/L 10 %SDS 20 2 % 1 mol/L DDT （现用现加） 0.0039 39μ mol/L 灭菌双蒸水加至 100 — A.1.4 精子洗涤液 4 DB14/ T 1518—2017 取1 mol/L NaCl 37.5 mL，0.5 mol/L的EDTA 5 mL，加双蒸水至250 mL。高压灭菌备用。 A.1.5 0.5mol／LEDTA溶液 1.86.1 g EDTA-Na2  2H2O溶于800 ml水中，用1 mol／L NaOH调PH至8.0，定容至1 000 mL，在103.4 kPa灭菌。 A.1.6 1 mol／L Tris-HCL溶液 60.55 g Tris-base溶于适量水中，加1 mol／L HCL调PH至8.0，定容至500 mL，103.4 kPa灭菌。 A.1.7 0.5 mol／L HCL溶液 25