65.020.99 B 30/39 ICS DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 1673—2018 荸荠茎尖组织培养技术规程 Technical specification for tissue culture seedling of Chinese water chestnut 2018 - 03 - 25 发布 广西壮族自治区质量技术监督局 2018 - 04 - 25 实施 发 布 — DB45/T 1673 2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 引用规范性文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 设施设备及常用化学试剂 ............................................................ 1 5 设施、设备及用具的清洁与消毒 ...................................................... 1 6 培养室环境条件控制 ................................................................ 2 7 工艺流程及操作要求 ................................................................ 2 8 合格组培苗形态指标 ................................................................ 3 9 生产管理规章制度 .................................................................. 3 附录 A（资料性附录） MS 培养基成分及母液配制 ......................................... 4 附录 B（资料性附录） 培养基植物生长调节剂的常用浓度及配制方法 ........................ 5 I — DB45/T 1673 2018 II — DB45/T 1673 2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所、广西标准化协会。 本标准主要起草人：陈丽娟、江文、高美萍、董伟清、蔡炳华、颜梅新、何芳练、蒋慧萍、张尚文、 欧昆鹏、王艳、黄诗宇、韦绍龙、闭志强、罗松、谢宏昭、桂杰、韦泽昭、苏宾。 III — DB45/T 1673 2018 荸荠茎尖组织培养生产技术规程 1 范围 本标准规定了荸荠（Elocharis tuberose Schulut）茎尖组织培养的术语和定义、设备设施及常用 化学试剂、设施、设备及用具的清洁与消毒、培养室环境条件控制、工艺流程及操作要求、合格组培苗 形态指标、生产管理规章制度等技术要求。 本标准适用于广西境内荸荠茎尖组培苗生产。 2 引用规范性文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2306—2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 荸荠 荸荠又称马蹄。莎草科荸荠属浅水性宿根草本植物。 3.2 荸荠茎尖组织培养 以荸荠球茎主芽茎尖或侧芽茎尖作为外植体，在人工控制的条件下，放在含有营养物质和植物生长 物质等组成的培养基中，使它得以继续生长、分化形成完整植株的过程。 4 设施设备及常用化学试剂 参照NY/T 2306—2013中的第4章执行。 5 设施、设备及用具的清洁与消毒 参照NY/T 2306—2013中的第6章、8.1、8.4、8.5、8.6、8.7和11.5执行。 1 — DB45/T 1673 2018 6 培养室环境条件控制 6.1 温度 ℃～30℃。 25 6.2 湿度 保持相对湿度30％～40％。 6.3 光照 接种后，先培养室全暗培养5 d～7 d，然后转入光培养，光照强度1 000lx～2 000lx，10 h/d～12 h/d。 7 工艺流程及操作要求 7.1 工艺流程 保存→培养基配制→材料选择与消毒→接种→初代培养(单芽)→继代培养（丛 材 选择 →炼苗(淘汰不合格苗)。 培养基母液配制与 芽） 生根 料 与培养 → 7.2 操作要求 7.2.1 培养基母液配制与保存 见 参 MS基本培养基成分及母液配制 附录A。植物生长调节剂的配制方法 中 用。具体操作 照NY/T 2306—2013中的7.3。 4 的 入 ℃ 冰箱 保存待 参见附录B。配制好的母液可放 7.2.2 培养基配制 ℃～ ℃热 +卡拉胶+量取 +糖→加水定容→搅匀调整pH→分装→封口→灭菌→凝固。具体 50 60 水 母液 操作 照NY/T 2306—2013中的7.4。 参 7.2.3 材料选择与消毒 选用种质纯正、遗传性状稳定的品种。取无病虫危害球茎，用清水漂洗干净，凉干表面水，用70％ 酒精擦拭表面，切取健壮的顶芽和侧芽，置于无菌瓶内，然后在超净台上，用70％酒精浸泡2 min，无 菌水冲洗2次后，再用0.1％升汞浸泡10 min～15 min,再用无菌水冲洗3～5次。 7.2.4 接种 在 无菌虑纸（或铝片）上切取含1～2个节(0.1 cm～0.2 cm)的芽尖放入备好的MS培养基。 7.2.5 初代培养(单芽) ( ℃± ℃) d后 选择生长势强的材料转接到MS+6-BA 1 mg～2.5 mg/L+NAA 0.01 mg～ mg L 上进行初代 诱导丛生芽。同时取材送病毒检测，淘汰带毒株系。 在 26 2 条件下培养15 ， 0.1 / 培养基 培养， 7.2.6 继代培养（丛芽） 将检测合格的丛生芽分切成带有2～3个芽点的小块放入备好的MS继代培养基上培养。一个继代周期 25 d～30 d。在培养过程中，控制增殖系数在3.0～5.0范围，继代次数10周期。 2 — DB45/T 1673 2018 7.2.7 生根材料选择与培养 在继代材料中选择叶色正常、生长健壮的材料，接种于袋装MS+PP 0.1 mg/L～0.35 mg/L+NAA 0.5 mg/L～1 mg/L生根培养基上,然后放置在温度(28℃±2℃)的光照培养室内培养7 d～10 d，待根系萌动, 苗高5 cm～8 cm时，即可移到炼苗棚培养。 333 7.2.8 炼苗(淘汰不合格苗) 在常温（15℃～40℃）自然散射光较强的大棚炼苗25 d～35 d，使叶状茎转粗变绿、根系粗壮、株 高≥7 cm，即可成为商品组培苗。淘汰生长异常（畸形、白化、,缺绿、叶状茎细弱等）的不合格苗。 8 合格组培苗形态指标 无污染，植株形态正常，且符合表1指标要求。 表1 荸荠组培苗形态指标 指标名称 指标值 株高(cm) ≥7 叶状茎粗（mm） ≥0.5 单株叶状茎数 ≥3 白根数(条) ≥2 植株叶色 浅绿色→浓绿 9 生产管理规章制度 9.1 生产管理制度 制定完善的规章制度和操作规程，并有效执行。 9.2 生产记录及档案建立 生产记录及档案建立内容包括有：母液配制及培养基配制记录、培养基高压蒸汽灭菌工作记录、员 工接种工作记录、组培材料继代和生根入出库记录、品种材料生产档案和产品销售记录。 3 — DB45/T 1673 2018 AA 附 录 A （资料性附录） MS 培养基成分及母液配制 见表A.1。 MS培养基成分及母液配制 表A.1 MS 培养基成分及母液配制表 母液编号 母液 1 母液 2 母液 3 母液 4 成分种类 大量元素 微量元素 螯合铁 有机质 化合物名称 规定用量 （mg/L） 扩大倍数 称取量 母液体积 （mg） （mL） NH4NO3 1 650 10 16 500 KNO3 1 900 10 19 000 MgSO4·7H2O 370 10 3 700 KH2PO4 170 10 1 700 CaCl2·2H2O 440 10 4 400 MnSO4·4H2O 22.3 100 2 230 ZnSO4·7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 NaMoO4·2H2O 0.25 100 25 CuSO4·5H2O 0.025 100 2.5 CoCl2·6H2O 0.025 100 2.5 Na2-EDTA 37.3 100 3 730 FeSO4·7H2O 27.8 100 2 780 甘氨酸 2.0 50 100 VB1 0.1 50 5 烟酸 0.5 50 25 VB6 0.5 50 25 肌醇 100 50 5 000 蔗糖 20 000 mg /L～30 000 mg/L 固化物 3 500 mg/L～5 000 mg/L 琼脂或卡拉胶 pH 5.8～6.2 水 母液用蒸馏水或重蒸水，培养基可用去离子水或自来水。 B 4 配制 1 L 培 养基吸取母 液量（mL） 1 000 100 1 000 10 1 000 10 500 10 — DB45/T 1673 2018 附 录 B （资料性附录） 培养基植物生长调节剂的常用浓度及配制方法 培养基植物生长调节剂的常用浓度及配制方法见表B.1。 表B.1 培养基植物生长调节剂的常用浓度及配制方法 类别 细胞分裂素 生长素 植物延缓剂 种类 常用浓度(mol) 配制方法 6