ICS 07.080 B 41 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5143—2019 畜禽组织及体液中多种抗生素残留 快速检测 微生物抑制法 2019 - 12 - 27 发布 河北省市场监督管理局 2020 - 01 - 28 实施 发 布 DB13/T 5143—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省农业农村厅提出。 本标准起草单位：河北省兽药监察所、河北科星药业有限公司、北京中检葆泰生物技术有限公司、 邢台市动物卫生监督所、衡水市农业环境与农畜产品质量监督管理站、沧州市农产品质量检验监测中 心、承德市畜禽水产品质量检验监测中心、石家庄市畜产品质量监测中心、石家庄市畜牧兽医技术开 发中心、唐山市食品药品综合检验检测中心。 本标准主要起草人：刘怡菲、王萍、王振来、刘龙飞、牛志勇、钱春彩、段培姿、王爱卿、刘力、 李云、张峰、闫超、李海龙、李文香、李研东、武侠均、赵芳、崔沙沙、陈宝明、李肖莉。 I DB13/T 5143—2019 畜禽组织及体液中多种抗生素残留快速检测 微生物抑制法 1 范围 本标准规定了畜禽组织及体液中β-内酰胺类、磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氨基 糖苷类、酰胺醇类七大类抗生素残留的微生物抑制法的制样和检测方法。 本标准适用于畜禽肾脏、肝脏、肌肉、血清和尿液中β-内酰胺类、磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、 大环内酯类、氨基糖苷类、酰胺醇类七大类抗生素残留的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 通过抑制微生物生长的检测方法来检测畜禽组织或体液中的抗生素。细菌在含有pH指示剂的琼脂 中培养，使用拭子对畜禽组织或体液进行提取，如果样品中不含有抗生素，细菌生长不受抑制，产生 的酸会使含有紫色指示剂的琼脂变成黄色；如果样品中含有抗生素，细菌生长会受到抑制，指示剂显 示紫色。 4 试剂和材料 除另有说明外，本法所用的试剂确认为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.1 检测试剂盒 a) b) c) d) e) f) g) h) 检测棒； 取样拭子； 洗脱反应缓冲液； 检测微管（含有微生物的固化培养基）； 阴性质控片：冷藏保存（2℃～8℃）； 阳性质控片Ⅰ：青霉素 G 标准品固体； 阳性质控片Ⅱ:庆大霉素标准品固体； 反应药片：用于尿液和血清样品的检测，冷藏保存（2℃～8℃）。 注：检测试剂盒是由Charm Science公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 4.2 阴性质控样品制备 1 DB13/T 5143—2019 4.2.1 组织类阴性质控样品制备：取出 1 片阴性质控片（4.1.2）放置在提供的带有螺帽的离心管中， 加入 1.0 mL 水，振荡 10 s 使阴性质控片（4.1.2）充分溶解。放置 5 min 后再次振荡，制成阴性质控 样品溶液,冷藏保存（2℃～8℃）,保存期为 5d。 4.2.2 血清和尿液阴性质控样品：直接使用阴性血清或阴性尿液样品作为阴性质控样品。 4.3 阳性质控样品Ⅰ的配制（用于肾脏、肝脏、肌肉、家畜血清和尿液样品的测定）：用 0.8 mL 阴 性质控样品（4.2）溶解阳性质控片Ⅰ（4.1.3），制成浓度为 50 ng/mL 的阳性质控样品Ⅰ。阳性质控 样品Ⅰ可冷藏保存（2℃～8℃）72 h；制备后 6 h 内置于-15℃以下冷冻，可保存 3 周，解冻的阳性质 控样品可冷藏保存（2℃～8℃）24 h。 4.4 阳性质控样品Ⅱ制备（用于家禽血清样品的检测）：用 10 mL 水溶解阳性质控片Ⅱ（4.1.4）， 制得浓度为 5000 ng/mL 的标准溶液。取 0.75 mL 上述标准溶液，加入 4.25 mL 阴性血清，制得阳性质控 样品Ⅱ，庆大霉素浓度为 750 ng/mL。 5 仪器设备 a) b) c) d) e) 孵育器：温度设置 64℃±1℃； 结果判读卡：见附录 B； 离心机：最高离心力大于 1200 g； 移液器及吸头：100 μ L～1000 μ L、20 μ L～200 μ L 和 1 mL～5 mL； 离心管：2 mL、10 mL 和 50 mL。 注：结果判读卡是由Charm cience公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 6 分析步骤 6.1 试样制备 6.1.1 肾脏和肝脏样品制备 将取样拭子（4.1.1.1）从检测棒中拔出,使用检测棒露出的开口端，插入新鲜的肾脏或肝脏皮质 约1 cm～2 cm 做环形切割，取渗出液用于检测。 6.1.2 肌肉样品制备 将肌肉样品匀质后速冻，然后快速解冻，将取样拭子（4.1.1.1）从检测棒中拔出,使用检测棒露 出的开口端，插入肌肉组织约1 cm～2 cm 做环形切割，取渗出液用于检测。 6.1.3 血清样品制备 将血液收集于50 mL离心管（5.5）中，放置4 h，弃去凝块，离心剩余液体（1200 g，5 min），收 集上清液。 移取500 μ L上清液至离心管中。加入反应药片（4.1.5），盖上离心管，10 s内点动式涡旋混合 10次，翻转3～5次，确保药片充分溶解。再次10 s内点动式涡旋混合10次，静置1 min。 6.1.4 尿液样品制备 2 DB13/T 5143—2019 移取500 μ L清亮的尿液于离心管中（如尿液浑浊，则1200 g离心5 min，取上清液备用），加入反 应药片（4.1.5）。盖上离心管， 10 s内点动式涡旋混合10次，翻转3～5次，确保药片充分溶解。再 次10 s内点动式涡旋混合10次，静置1 min。 6.2 样品移取 6.2.1 肾脏、肝脏和肌肉样品 握住取样拭子（4.1.1.1），将棉签头插入肾脏、肝脏或肌肉组织的环形切口，顺时针移动同时旋 转约30 s，使拭子吸附汁液至完全浸湿，去除拭子上的组织颗粒。 6.2.2 血清和尿液样品 打开离心管，将取样拭子（4.1.1.1）从检测棒中拔出，浸入样品上清液中，浸泡10 s。 6.3 样品检测 6.3.1 将孵育器（5.1）设置为 64 ℃，待温度稳定后进行检测。 6.3.2 垂直缓慢旋转手柄，把取样拭子（4.1.1.1）插入检测棒中，先拧到一半，使拭子刺破上层密 封箔膜并完全浸没到上层洗脱反应缓冲液(4.1.1.2)中，但不刺破下层密封箔膜，等待 2 min。旋下拭 子，使拭子到达微管底部琼脂上方，轻敲微管底部使上层液体完全进入微管底部，旋出拭子，再次轻 敲微管底部 5 次，按照检测试剂盒标注时间孵育。孵育结束，取出微管放至室温。 7 结果判定 与结果判读卡（5.2）进行颜色比对，目视判定。 a) 阴性：琼脂颜色为黄色或者黄/绿色为阴性结果； b) 可疑：琼脂下半部分为黄色或黄绿色，上半部分为蓝色/紫色或棕色为可疑结果； c) 阳性：琼脂颜色为蓝/紫色为阳性结果。 8 阳性样品和可疑样品确认 当样品检测结果判为阳性或可疑时，应采用国家标准方法进行确证。 9 检出限 方法检出限见表1。 表1 方法检出限表 药物名称 英文名称 青霉素 G 检出限(μ g/kg) 肾脏、肝脏、肌肉、家禽血清 家畜血清和尿液 Penicillin G 35 35 氨苄西林 Ampicillin 40 40 阿莫西林 Amoxicillin 40 40 3 DB13/T 5143—2019 表1 方法检出限表（续） 4 药物名称 英文名称 氯唑西林 检出限(μ g/kg) 肾脏、肝脏、肌肉、家禽血清 家畜血清和尿液 Cloxacillin 200 200 苯唑西林 Oxacillin 150 150 头孢噻呋 Ceftiofur* 800 800 头孢匹林 Cephapirin* 100 100 头孢氨苄 Cefalexin 150 150 头孢喹肟 Cefquinome 40 40 甲氧苄啶 Trimethoprim 40 40 磺胺二甲氧嗪 Sulfadimethoxypyrimidine 50 50 磺胺二甲嘧啶 Sulfadimidine 30 30 磺胺甲基异恶唑 Sulfisoxazole 70 70 磺胺甲氧嗪 Sulfamethoxypyridazine 70 70 磺胺甲嘧啶 Sulfamerazine 50 50 磺胺类 Sulfonamide 30 30 达氟沙星 Danofloxacin 40 40 二氟沙星 Difloxacin 200 200 恩诺沙星 Enrofloxacin 60 60 氟甲喹 Flumequine 400 400 沙拉沙星 Sarafloxacin 8 8 洛美沙星 Lomefloxaxin 1 1 氧氟沙星 Ofloxacin 1 1 诺氟沙星 Norfloxacin 1 1 培氟沙星 Pefloxacin 1 1 恶喹酸 Oxolinic Acid 80 80 土霉素 Oxytetracycline 150 150 四环素 Tetracycline 100 100 金霉素 Chlortetracycline 150 150 多西环素 Doxycycline 70 70 泰乐菌素 Tylosin 65 65 红霉素 Erythromycin 70 70 吡利霉素 Pirlimicin* 80 80 替米考星 Tilmicosin 50 50 DB13/T 5143—2019 表1 方法检出限表（续） 药物名称 英文名称 拖拉霉素 检出限(μ g/kg) 肾脏、肝脏、肌肉、家禽血清 家畜血清和尿液 Tulathromycin* 400 400 螺旋霉素 Spiramycin 150 150 林可霉素 Lincomycin 50 50 庆大霉素 Gentamicin 50 50 链霉素 Streptomycin 400 400 双氢链霉素 Dihydrostreptomycin 400 400 卡那霉