(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211202219.0 (22)申请日 2022.09.29 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 徐蕴晨　吴昀　夏宜平　高聪　 吕群丹　洪碧伟　闵芮涵　 (74)专利代理 机构 杭州合信专利代理事务所 (普通合伙) 33337 专利代理师 沈自军 (51)Int.Cl. G01N 1/30(2006.01) G01N 1/28(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 离体条件下向百合鳞茎引入荧光染料的方 法 (57)摘要 本发明提供了一种离体条件下向百合鳞茎 引入荧光染料的方法及研究离体百合植株同化 运输方向和路径的荧光示踪 方法。 所述离体条件 下向百合鳞茎引入荧光染料的方法包括： 步骤 S10、 以在诱芽培养基中经代谢培养的离体百合 鳞茎的外层鳞片为待处理鳞片， 无菌条件下， 在 所述待处理鳞片的远轴端中部设置楔 形切口， 所 述楔形切口贯穿维管束； 步骤S20、 在所述楔形切 口内塞入吸水材料， 向所述吸水材料注入荧光染 料； 步骤S30、 注入结束后， 对所述楔形切口进行 封闭和避光处理。 本发明中荧光染料的引入不需 要专门的设备和装置， 可快速、 有效地使离体百 合鳞茎获得理想的标记结果。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 115541350 A 2022.12.30 CN 115541350 A 1.离体条件下向百合鳞 茎引入荧 光染料的方法， 其特 征在于， 包括： 步骤S10、 以在诱芽培养基 中经代谢培养的离体百合鳞茎的外层鳞片为待处理鳞片， 无 菌条件下， 在所述待处 理鳞片的远轴端中部设置楔形切口， 所述楔形切口贯 穿维管束； 步骤S20、 在所述楔形切口内塞入吸水 材料， 向所述吸水 材料注入荧 光染料； 步骤S30、 注入结束后， 对所述楔形切口进行封闭和避光处 理。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S10中， 利用刀片在所述待处理鳞片的 远轴端中部切出楔形切口。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 步骤S20中， 吸水 材料为医用药棉； 所述荧光染料为CFDA荧 光染料溶液， 且浓度为1‑2mg/mL。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 每个外层鳞片注入所述CFDA荧光染料溶液 的体积为10 ‑60 μL。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S30中， 所述封闭和避光处理为： 依次 用封口膜和锡箔纸包裹所述外层鳞片的楔形切口。 6.根据权利要求1～5任一所述方法得到的离体百合鳞 茎。 7.一种研究离体百合 植株同化 运输方向和路径的荧 光示踪方法， 其特 征在于， 包括： 采用权利要求1～5任一所述方法， 得到引入荧 光染料的离体百合鳞 茎； 将所述离体百合鳞 茎置于培养基中进行培 养； 取出培养后的离体百合鳞茎， 在拟观察部位进行取样， 并制备成显微标本， 对所述显微 标本进行显微观察和拍照。 8.根据权利要求7 所述的荧 光示踪方法， 其特 征在于， 所述培 养时间为12 ‑48h。 9.根据权利要求7所述的荧光示踪方法， 其特征在于， 所述取样为利用冷冻切片机对拟 观察部位进行切片。 10.根据权利要求7 所述的荧 光示踪方法， 其特 征在于， 所述切片厚度为3 5 μm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541350 A 2离体条件下向百 合鳞茎引入荧光染料的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 植物细胞生理学研究技术领域， 特别是涉及离体条件下向百合鳞茎引 入荧光染料的方法。 背景技术 [0002]百合(Lilium  spp.)被誉为球根花卉之王， 是全球切花生产和绿化美化的首要球 根花卉之一。 百合具球形鳞茎， 膨大的鳞片贮藏着丰富的营养物质， 具备较高的药用和食用 价值， 且鳞茎大小与百合 开花的品质密切相关， 因此 百合鳞茎有着极大的研究和开发价 值。 [0003]光合同化物运输是决定作物产量和品质的重要因素之一。 “源”通常指植物体内能 产生碳水化合物的光合组织； “库”主要为碳水化合物的积累和使用组织。 高等植物中， 物质 运输主要在维管束中进 行， 其中， 韧皮部是负责同化物运输的主要组织。 韧皮部同化物运输 过程存在两条途径： 共质体途径(symplast  pathway)和质外体途径(apoplastic   pathway)， 前者通过胞间连丝进行， 后者则通过跨膜 运动进行， 需要特定的载体以及能量的 驱动。 [0004]百合鳞茎中物质的积累以淀粉和蔗糖为主， 作为典型的 “源‑库”复合体， 在生长 发 育过程中经历多次 “源‑库”角色转换， 转换过程中碳水化合物的代谢对于植物生长及开花 品质具有重要作用。 离体条件下， 小鳞茎则主要作为库器官， 培养基中的蔗糖是百合小鳞茎 发生和发育主要的 “源”， 其作为百合中主要运输态碳水化合物经韧皮部运输进入小鳞茎供 生长所需或者转化为淀粉贮藏在鳞片中促使小鳞茎增大。 蔗糖不仅是百合鳞茎主要成分 (淀粉)的重要前体物质， 而且可作为信号分子参与调节鳞茎发生发育过程相关基因的表 达、 鳞茎“源‑库”角色的转换以及整个植物 “源‑库”活性的高低。 因此探明百合小鳞茎形成 过程中同化物运输方向及路径有助于了解鳞茎内糖的积累和转化方式， 对于生产优质百合 鳞茎和切花具有重要的理论 意义和实践价值。 [0005]5(6)羧基荧光素酯(CFDA)是一种比较理想的共质体标记物。 其原理如下： CFDA在 进入细胞后被分解为膜 不透过性的荧光 染料5(6)羧基荧光素(CF)， 只能通过胞间连丝等共 质体途径在细胞和组织间进行转运。 通过荧光显微镜观察CF在库器官内的分布情况， 就能 了解韧皮部同化物运输的途径。 [0006]关于百合鳞茎同化物运输途径的研究主要集中在活体百合上， 而离体条件下的相 关研究则较少。 相比于活体条件， 离体体系对于培养条件的可控性更强， 且可以确保植物材 料基因型的一致。 此外， 与活体条件下百合鳞茎 “库‑源”角色的多次转换相比， 离体条件下 百合小鳞茎承担的角色更为明确——主要作为库器官存在， 因此离体体系能够为百合鳞茎 同化物运输途径的研究提供 更为科学严谨的条件。 [0007]然而， 离体体系下百合小鳞茎中荧光示踪剂的引入要求无菌 的实验环境， 且对实 验操作的要求更高， 例如在CFDA标记过程中， 其他作物上采用的电流注射法和压力注射法 需要专门的设备且技术要求高， 而Eppendorf管棉线渐渗法和叶片涂抹法虽然不需要专门 的设备， 但操作过程繁琐、 容易损伤植株内部结构， 且荧光染料溶液蒸发， 均难以达到理想说　明　书 1/5 页 3 CN 115541350 A 3