ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3093—2019 肝吸虫囊蚴检测 荧光定量 PCR 法 etection method of real time quantitative PCR for Clonorchis sinensis metacercaria 2019 - 12 - 25 发布 吉林省市场监督管理厅 2020 - 02 - 01 实施 发 布 DB22/T 3093—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：曹利利、宫鹏涛、郭衍冰、董航、苑淑贤、姚新华、程荣华、邵洪泽、程敏、 李文东、李金龙、赵玉龙。 I DB22/T 3093—2019 肝吸虫囊蚴检测 荧光定量 PCR 法 1 范围 本标准规定了肝吸虫囊蚴荧光定量PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于肝吸虫囊蚴的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 SYBR Green I：一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（SYBR Green Ndcleic Acid Gel Stains） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） Ct值：循环阈值（Cycle threshold） 4 原理 根据肝吸虫囊蚴基因特定的序列设计合成一对特异性引物，在反应体系中SYBR Green I 与双链 DNA 结合发出荧光，通过检测 PCR 反应液中的荧光信号强弱，实现对目的基因的准确定量。随着 PCR 反应 的循环进行，PCR 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 5 试验条件 5.1 生物安全措施 所有培养物和废弃物的处置应符合GB 19489的规定执行。 5.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。 6 试剂和材料 1 DB22/T 3093—2019 6.1 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 6.1.1 动物组织基因提取试剂盒。 6.1.2 阳性对照，为肝吸虫囊蚴 DNA，或含有附录 A.3 序列的质粒 DNA。 6.1.3 阴性对照，为 ddH2O。 6.1.4 SYBR Green qPCR Master Mix（2×）。 6.1.5 ROX Reference Dye（50×）。 6.2 耗材 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.3 荧光定量 PCR 反应管。 离心管，1.5 mL、0.5 mL、0.2 mL。 吸头，200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL。 引物 上游引物 P1：5'- TCTGGGTAGGGTGGTTTGA- 3' 下游引物 P2：5'- ATAGACGCTCCCGAGTTCC- 3' 使用时配制成10 μmol/L工作液，置-20 ℃保存，6 个月内使用。 7 仪器 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 8 分析天平，感量 0.1 g。 研钵。 高速冷冻离心机，12 000 r/min 以上。 荧光定量 PCR 仪。 高压蒸汽灭菌器。 微量移液器，200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL。 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100 ℃。 冰箱，-20 ℃±2 ℃。 样品 采集不少于500 mg（7.1）肝吸虫囊蚴宿主的肌肉，避免污染。样品应-20 ℃保存，冷藏运输，不 能在24 h内送达实验室的样品应冷冻状态运送。 9 操作步骤 9.1 模板的制备 样品研磨均匀（7.2），采用动物组织基因提取试剂盒（6.1.1）提取待检样品、阳性对照（6.1.2）、 阴性对照（6.1.3）DNA作为模板，操作方法按说明书进行。 9.2 2 反应体系 DB22/T 3093—2019 采用25 μL反应体系，在荧光定量PCR反应管（6.2.1）中依次加入表 1所示的试剂后，盖紧管盖， 瞬时离心混匀（7.3），避免产生气泡，做好标记，置于荧光定量PCR仪（7.4）中扩增。 表1 9.3 荧光定量 PCR 反应体系 成分 用量/μL SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 P1 1.5 P2 1.5 ROX Reference Dye 0.5 DNA 模板 2.0 ddH2O 7.0 总计 25.0 反应程序 ——第一阶段，95℃预变性 5min； ——第二阶段，95℃变性 5 s，57 ℃退火 30 s，40 个循环。 在第二阶段57 ℃退火30 s处设置收集荧光信号，观察扩增曲线。 10 结果判定 10.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩 增曲线的最高点为准。 10.2 质控标准 10.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 10.2.2 阳性对照的 Ct 值应＜30，并出现典型的扩增曲线。 10.2.3 阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件则实验视为无效。 10.3 结果描述及判定 10.3.1 阴性判定 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无肝吸虫囊蚴核酸。 10.3.2 阳性判定 Ct值＜35，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在肝吸虫囊蚴核酸。 35≤Ct值＜40，应进行重复试验。如果重复试验的Ct值＜40，且曲线有明显的对数增长期，判为阳 性反应。 _________________________________ 3