ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3111—2020 猫杯状病毒检测 实时荧光 RT-PCR 法 Detection method of real time quantitative RT-PCR for Feline calicivirus 2020 - 03 - 16 发布 吉林省市场监督管理厅 2020 - 03 - 30 实施 发 布 DB22/T 3111—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：胡桂学、王开、郭衍冰、姜雪、黄海龙、呼延含蓉、赵艳丽、程荣华、伊淑帅、 牛江婷。 I DB22/T 3111—2020 猫杯状病毒检测 实时荧光 RT-PCR 法 1 范围 本标准规定了猫杯状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、结 果判定和废弃物处理的技术要求。 本标准适用于猫杯状病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct 循环阈值 （Cycle threshold） Cdna 互补脱氧核糖核酸 （Complementary Deoxyribonucleic acid） DMEM 改良Eagle培养基 （Dulbecco's modification of Eagle's medium） ORF 开放阅读框 （Open Reading Frame） RNA 核糖核酸 （Ribonucleic acid） RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 （Reverse transcription polymerase chain reaction） 4 原理 根据猫杯状病毒衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列，设计引物和探针。探针在5’端标记FAM荧光素作 为报告荧光基团，3’端标记Eclipse作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的 基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；反应 进入延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来， 所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式 增长，荧光信号也相应增长。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越 多，Ct值越小。 5 5.1 试剂和材料 试剂 1 DB22/T 3111—2020 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 5.1.1 DMEM 培养液。 5.1.2 液氮。 5.1.3 RNA 提取试剂盒。 5.1.4 反转录试剂盒。 5.1.5 阳性对照，为猫杯状病毒的细胞培养物或非感染性体外转录 RNA。 5.1.6 阴性对照，为不含猫杯状病毒的细胞培养液。 5.1.7 无 RNA 酶的水（Rnase free water）。 5.1.8 Taq 酶。 5.2 材料 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.3 无菌拭子。 离心管，1.5 mL、15 mL 和 50 mL。 吸头，200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL 和 0.5 μL～10 μL。 无 RNA 酶吸头，200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL 和 0.5 μL～10 μL。 无 RNA 酶离心管，0.2 mL 和 1.5 mL。 研钵。 荧光定量 PCR 反应管, 根据荧光 PCR 仪要求选择单管、八连排管或 96 孔荧光反应板。 引物和探针 引物及探针使用时配制成表 1 中浓度，置-20 ℃保存，6 个月内使用。 表1 序列 浓度 5’―3’ μmol/L 上游引物 F CTGACTTCAAATTTCATCTC 0.20 下游引物 R TGGGAATTAAGTCAGAGG 0.20 探针 (FAM) ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC (Eclipse) 0.40 引物和探针名称 6 引物序列和浓度 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 7 冰箱，-20±2 ℃，-80±2 ℃。 高速冷冻离心机，12 000 r/min 以上。 可调移液器，200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL 和 0.5 μL～10 μL。 天平，感量 0.01 g。 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100 ℃。 荧光定量 PCR 扩增仪。 样品 7.1 2 样品的采集 DB22/T 3111—2020 7.1.1 将无菌拭子（5.2.1）在口腔和鼻腔内，刮取分泌物，将拭子插入离心管（5.2.2）中，加盖并 标记，冷藏送检。 7.1.2 组织样品主要采集气管和肺脏，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，做好标记，冷藏送检。 7.2 样品的处理 7.2.1 口鼻拭子的处理 拭子样品用 600 μL DMEM（5.1.1）浸润后，3 000 r/min 离心（6.2）15 min，取上清液 500 μL （6.3、5.2.4）于 1.5 mL 无 RNA 酶离心管（5.2.5）中。 7.2.2 组织处理 采取不少于 500 mg（6.4）的组织样品，在研钵（5.2.6）内加液氮（5.1.2）研磨，收集于 1.5 mL 无 RNA 酶的离心管（5.2.2）中。 8 试验步骤 8.1 模板的制备 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.2 使用 RNA 提取试剂盒（5.1.3）提取样品 RNA，操作方法按说明书进行。 采用反转录试剂盒（5.1.4、6.5）制备待检样品的 cDNA 作为模板，操作方法按说明书进行。 阳性对照（5.1.5）、阴性对照（5.1.6）均按照待检样品操作方法进行。 反应体系 在荧光定量PCR反应管（5.2.7）中依次加入表 2 所示的试剂后，盖紧管盖，震荡混匀，瞬时离心。 表2 8.3 反应体系 试剂 剂量 Rnase free water 8.5 μL 模板 2.0 μL 上游引物 F 0.5 μL 下游引物 R 0.5 μL 探针 1.0 μL Taq酶 12.5 μL 总体积 25.0 μL 反应程序 将荧光定量 PCR 反应管放入荧光定量 PCR 扩增仪（6.6）内，记录样品摆放顺序。循环参数设置见 表 3 。在第二步 55 ℃退火 10 s 处设置收集荧光信号。 3 DB22/T 3111—2020 表3 反应步骤 温度℃ 时间 s 循环数次 第一步 95 30 1 95 5 55 10 72 20 第二步 9 反应程序 40 结果判定 9.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器 可根据仪器型号进行调整。 9.2 质控标准 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.3 阴性对照无 Ct 值，并且无扩增曲线。 阳性对照的 Ct 值应≤35，并出现特定的扩增曲线。 如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，试验视为无效。 结果描述及判定 9.3.1 阴性判定 无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猫杯状病毒核酸，判为阴性。 9.3.2 阳性判定 9.3.2.1 Ct 值≤35，出现特定的扩增曲线，表示样品中存在猫杯状病毒核酸，判为阳性。 9.3.2.2 35＜Ct＜40，应进行重复试验。如果重复试验的 Ct 值＜40，且曲线有明显的对数增长期， 判为阳性。 10 废弃物处理 10.1 检测的样品及接触物，应收集后高压灭菌处理，防止污染措施应符合 GB/T 27401 的规定。 10.2 检测过程中的废弃物及个人防护，应符合 GB 19489 的规定。 _________________________________ 4