ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3407—2019 猪流行性腹泻病毒 IgA 抗体间接 ELISA 检测 方法 Indirect ELISA to detect antidody against porcine epidemic diarrhea virus 文稿版次选择 2019 - 11 - 04 发布 安徽省市场监督管理局 2019 - 12 - 04 实施 发 布 DB34/T 3407—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省动 物卫生监督所、霍邱县动物卫生监督所、广德县畜牧兽医水产局、合肥市动物疫病预防与控制中心、含 山县畜牧局、怀宁县平山镇农业站。 本标准主要起草人：潘孝成、洪功飞、沈学怀、李雪松、王扬龙、赵瑞宏、张丹俊、戴银、胡晓苗、 侯宏艳、周学利、陈曦、陈福军、钱昌银、胡业和、程志清。 I DB34/T 3407—2019 猪流行性腹泻病毒 IgA 抗体间接 ELISA 检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒 IgA 抗体的间接 ELISA 检测方法。 本标准适用于猪流行性腹泻病毒 IgA 抗体检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus） ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay） HRP：辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase） OD：光密度（Optical Density） IgA：免疫球蛋白A（Immunoglobulin A） 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 4 4.1 主要仪器 37℃培养箱。 酶联免疫检测仪。 酶联反应板 微量移液器（10 µL、100 µL、1000 µL）和吸头。 多道移液器（10 µL、100 µL、300 µL） 台式低温高速离心机 试剂和材料 PEDV 纯化浓缩抗原 7.35 将第 30 代 PEDV-HX 株（TCID50=10 /0.1 mL）接种 VERO 单层细胞，接毒后 72 小时收集病毒 培养物（含细胞和培养液），冻融 3 次，加入 1/10 体积的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，室温 振荡 10 min，6000 r/min 4℃高速离心 20 min，收集上清液；取上清液 45000 r/min 4℃超速离心 120 min。弃去上清液，沉淀用 0.01 mol/L pH 为 7.4 的 PBS 充分溶解（PBS 使用量按原来病毒培养物体 积的 1/20），即为 PEDV 纯化浓缩抗原（测得蛋白浓度为 3.8 mg/mL）。 4.2 酶结合物 商品化的 HRP 标记的抗猪 IgA 抗体，工作浓度参照产品说明书。 4.3 标准阳性乳汁 PEDV 疫苗免疫健康猪制备，经琼扩法测抗体效价 ≥1:64。 1 DB34/T 3407—2019 4.4 标准阴性乳汁 未免疫 PEDV 疫苗且未感染 PEDV 的健康猪乳汁，经琼扩检测为阴性。 4.5 包被液 称取碳酸钠 1.0 g 和碳酸氢钠 3.0 g 溶于 1000 mL 去离子水，调节 pH 值至 9.4～9.6。 4.6 磷酸盐缓冲液 称取十二水合磷酸氢二钠 0.25 g、二水合磷酸二氢钠 3.5 g 和氯化钠 8.5 g，溶于 800 mL 去离 子水中，调节 pH 值至 7.2～7.6，用去离子水定容至 1000 mL。 4.7 封闭液 称取牛血清白蛋白 3.0 g，溶于 100 mL 磷酸盐缓冲液。 4.8 洗涤液 先配制 20 倍浓缩洗液，称取十二水合磷酸氢二钠 5.0 g、二水合磷酸二氢钠 70.0 g、氯化钠 170.0 g、吐温-20 16.0 mL，加去离子水 800 mL，调节 pH 值至 7.4～7.6，用去离子水定容至 1000 mL，121℃ 15 min 高压灭菌后，室温存放备用。使用前，将 20 倍浓缩液用蒸馏水或去离子水按 1:19 的比例混 合即可。 4.9 稀释液 量取 5.0 mL 牛血清溶于 95.0 mL 磷酸盐缓冲液中。 4.10 底物液 A 称取 TMB 200.0 mg，无水乙醇（或二甲基亚砜）100 mL，加双蒸馏水至 1000 mL。 4.11 底物液 B 十二水合磷酸氢二钠 14.60 g、柠檬酸 9.33 g、0.75％过氧化脲 6.4 mL，加三蒸馏水至 1000 mL， 调节 pH 值至 5.0～5.4。 4.12 终止液 将去离子水与浓盐酸（36％～38％）以 9:1 的比例混合即可，室温保存。 4.13 商品化试剂盒 可选择同类商品化试剂盒。 5 样本的采集及处理 用 1.5 毫升的高压灭菌消毒离心管采集母猪产后 3 日内的初乳，样本量不少于 500 µL，12000 rpm 离心 3 min，收集中间层的乳清，-20℃保存备用。 6 操作步骤 2 DB34/T 3407—2019 6.1 包被 用包被液将 PEDV 纯化浓缩抗原稀释至 2 µg/mL，按 100 µL/孔 加入酶联反应板中，2～8℃包被 16 小时。包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液 300 µL，洗涤 1 次。 6.2 封闭 每孔加入新鲜配制的封闭液 300 µL/孔，37℃封闭 3 小时。封闭结束后，弃去孔中液体，每孔加 入洗涤液 300 µL，洗涤 1 次。 6.3 加检测样本 将待测检样本用稀释液作 1:10 稀释后，加入抗原包被板中，100 µL/孔，同时加入标准阴性、阳 性对照各两孔，100 µL/孔，37℃反应 1 小时。弃去孔中液体，每孔加入洗涤液 300 µL，洗涤 5 次， 吸水纸拍干。 6.4 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至工作浓度，加入抗原包被板中，100 µL/孔， 37℃反应 1 小时。弃去 孔中液体，每孔加入洗涤液 300 µL，洗涤 5 次，吸水纸拍干。 6.5 显色 将底物液A 和底物液B 等体积混合，混合后立即加入抗原包被板中，每孔 100 µL，37℃避光反应 10 分钟。 6.6 终止反应 每孔加入终止液 100 µL。 6.7 读 OD 值 在酶联免疫检测仪 450 nm 波长处读取各孔 OD 数值。 7 结果判定 7.1 结果计算 P/N 计算，P/N=检测样品两孔平均 OD450 值/阴性对照两孔平均 OD450 值。 7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 判定 阳性对照两孔平均 OD450 值≥0.5，阴性对照两孔平均 OD450 值≤0.2，判定实验条件成立。 当 P/N≥2.1，判为阳性，P/N<2.1，则判为阴性。 使用商品化试剂盒时，按其说明书进行操作和判定。 _________________________________ 3