ICS 65.020 B 34 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 2028—2019 甘蔗组织培养污染控制操作规程 Technical regulations for aseptic operation procedure of sugarcane tissue culture 2019 - 12 - 05 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2019 - 12 - 30 实施 发 布 — DB45/T 2028 2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 术语和定义 ........................................................................ 1 3 甘蔗组织培养消毒灭菌 .............................................................. 1 4 接种转管消毒灭菌 .................................................................. 2 5 培养室日常清洁和消毒管理 .......................................................... 4 6 污染培养容器清洗处理 .............................................................. 4 7 建立档案 .......................................................................... 4 I — DB45/T 2028 2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区糖业生产办公室提出并宣贯监督。 本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所。 本标准主要起草人：李松、刘红坚、卢曼曼、刘俊仙、刘丽敏、张荣华、余坤兴、何毅波、刘欣、 张伟珍。 III — DB45/T 2028 2019 甘蔗组织培养污染控制操作规程 1 范围 本标准规定了甘蔗组织培养污染控制的术语和定义、甘蔗组织培养消毒灭菌、接种转管消毒灭菌、 培养室日常清洁和消毒管理、污染培养容器清洗、建立档案。 本标准适用于甘蔗组织培养污染控制。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 内源性污染 endogenous pollution 外植体内部所带细菌或真菌等微生物所造成的污染。 2.2 外源性污染 exogenous pollution 人为操作不当以及环境因素所引起的污染。 2.3 接种 vaccinate 外植体经消毒灭菌处理后接入到有新鲜培养基的培养容器中的过程。 2.4 转管 tube tranefer 组织培养材料从原培养容器转移到有新鲜培养基的培养容器中的过程。 3 甘蔗组织培养消毒灭菌 3.1 培养基灭菌 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 培养基采用高压蒸汽灭菌器进行高温高压湿热灭菌。 灭菌程序及安全操作技术按高压蒸汽灭菌容器操作说明进行。 在压力 0.11 MPa 或 0.14 MPa、温度 121 ℃ 条件下保持灭菌时间 20 min ～30 min。 经过灭菌处理的培养基在储藏室放置 5 d ～7 d 后，污染率≤ 5.0％。 1 — DB45/T 2028 2019 3.2 接种室清洁、消毒 3.2.1 操作使用前 先用吸尘设备吸干净接种室地面尘埃，再用湿拖把拖擦 1～2 遍。 打开接种室紫外灯 30 min 以上，同步开启臭氧发生器。 关闭紫外灯及臭氧消毒机 30 min 后，工作人员进入接种室进行操作。 3.2.1.1 3.2.1.2 3.2.1.3 3.2.2 操作结束后 3.2.2.1 3.2.2.2 吸尘设备吸尘后用 0.1％～0.2％苯扎溴铵溶液擦拭地板 1～2 遍。 打开紫外灯或臭氧发生器 1 h ～2 h。 3.3 工作人员的清洁和消毒 3.3.1 3.3.2 3.3.3 进入接种室前，先用洗手液和自来水洗净双手，后更换专用鞋子、穿工作服、戴帽子和口罩。 用 75 ％ 乙醇溶液擦拭所戴手套或双手。 操作结束后，在缓冲间脱下专用工作服、帽子和口罩，放回原位；离开缓冲间换下专用鞋子。 3.4 工作人员用品的清洁和消毒 3.4.1 3.4.2 工作服、帽子、专用鞋子、口罩等，1 d ～2 d 清洗、替换 1 次。 使用过的工作服、帽子等，每周和培养基一起高压灭菌 1 次。 3.5 超净工作台的消毒 先开超净工作台的紫外灯 30 min，后开风机 30 min 以上。 对超净工作台的顶部、左右壁及台面、接种转管用具、灭菌器表面等用 75％的乙醇溶液进行喷 雾消毒。 3.5.3 转管工作结束后，先开启紫外灯 30 min 后关闭风机，再关紫外灯。 3.5.1 3.5.2 3.6 接种转管工具的消毒灭菌 每天接种转管所用的剪刀、镊子、刀子等工具，与培养基一起在高压蒸汽灭菌器内进行高温高 压湿热灭菌 1 次。 3.6.2 已灭菌的接种转管工具不得与未灭菌培养瓶或物品混放。 3.6.3 转管前,将 3.6.1 灭菌的接种转管工具用 75％的乙醇溶液擦拭，然后在 250 ℃以上的专用电热 灭菌器中灭菌 30 s 以上。 3.6.4 每接种转管 1 次，所使用的工具置于盛有 75％的乙醇溶液瓶中浸洗，按 3.6.3 方法进行高温灭 菌备用。 3.6.5 操作工作结束后，所有使用过的剪刀、镊子、刀子等工具，先用自来水清洗干净，再按 3.6.1 方法进行消毒灭菌。 3.6.1 4 接种转管消毒灭菌 4.1 外植体的选取和预处理 在甘蔗生长旺盛期，选择生长健壮、无病虫害、具有本品种典型特征的健康新植蔗植株的侧芽、 幼嫩叶鞘等器官或组织。 4.1.1 2 — DB45/T 2028 2019 连续晴天 早 露水 集 c c + 叶肥厚带以下 2 cm ～3 cm 处砍 田 对 株 离 去叶片 留完整 叶鞘 回实验 次 乙醇溶液 拭表面 1～2 次。 毛巾 拭 表 4.1.2 3 d～5 d，并在 上 干后采 外植体。 4.1.3 在 间 甘蔗植 下部 地面以上 15 m ～20 m 处、上部从 1 下， ，保 的 ，放在干净容器中带 室。 擦 4.1.4 用干净 擦 外植体 面 2 ～3 ，后用 75％的 4.2 接种的消毒灭菌 4.2.1 叶鞘幼嫩组织 取 个嫩节 鞘 乙醇溶液 拭表面 1 次，放入超净工作台。 剥去 层老叶鞘 每剥一层叶鞘更换一次 刀片。 幼嫩 诱导 胚性 胞团 诱导 4.2.1.1 带有 1～2 的 部，用 75％的 擦 4.2.1.2 外 ， 灭过菌的 4.2.1.3 内部 组织 培养产生 细 。 4.2.1.4 培养污染率 5.0％ ～7.0％。 4.2.2 腋芽 剥去 茎叶鞘 乙醇溶液 拭表 次 刀片将腋芽 段 剥离，自来水冲洗 超 工 台 将预 腋芽 无 倒 乙醇溶液浸泡 10 s ～30 s 将乙醇倾去 无 水冲 次 次氯酸钠溶液浸泡 断轻摇；倒出灭菌液， 无 水冲 次 腋芽分 丛 小苗 分 4.2.2.1 蔗 ，用 75％的 擦 面 1 ，用 从蔗 中 20 min ～30 min。 4.2.2.2 在 净 作 上 处理过的 ，放入 菌的容器中， 入 75％的 ， ，用 菌 洗 2～3 。 10 min ～15 min，处理过程中要不 4.2.2.3 用 1.0％ ～2.0％的 用 菌 洗 3～5 后备用。 4.2.2.4 化培养产生 生 。 4.2.2.5 化培养污染率 5.0％ ～10.0％。 4.2.3 茎尖 芽 茎 段剥离芽苗 超 工 酸钠溶液浸泡 剥去 芽 茎尖分 茎尖分 取健 芽苗 来水冲 8 乙醇溶液 拭表 次 ； s s 台 乙醇溶液浸泡芽苗 ；倒 液 无 水冲 次 层叶鞘 取茎尖 每剥一层叶鞘更换一次 刀片 针 丛 小苗 壮蔗 ，用自 洗干净，从蔗 4.2.3.1 单 蔗 在 3 ℃ ～40 ℃条件下培养 10 d ～20 d， ，再用 75％ 擦 面 2 后带入接种室 4.2.3.2 在 净 作 内先用 75％ 材料 10 ～30 后，再用 1.0％ ～2.0％的 出灭菌 ，用 菌 洗 2 ～3 。 10 min ～15 min 4.2.3.3 蔗 外 ， 组织。 灭过菌的 或接种 。 4.2.3.4 化培养产生 生 。 4.2.3.5 化培养污染率 4.0％ ～6.0％。 4.3 转管 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 行。 4.3.6 4.3.7 4.3.8 对 次氯 疑似 一律去除 乙醇溶液 拭 表 次 包扎 好 其他 品 应 超 工 台 每次 宜 多 待 应拿 斜角 避免 落 ； 与送风 流动方向平 每转管 1 次，转管工具按 3.6 方法灭菌放凉后备用。 每次转完超净工作台内材料后，用 75％的乙醇溶液消毒双手和工作台面。 转管前 污染或 污染的材料 。 擦 培养容器 面 1 。 准备转管的材料，用 75％ 的 培养基、准备进行转管的材料及 灭菌 的 物 ， 在 净 作 内开启。 在操作区内， 不 放入过 的 用培养基和材料。 打开培养容器时， 成 ，以 尘埃 入培养容器中 培养容器口 的 转管材料污染率 3.0％ ～5.0％。 3 — DB45/T 2028 2019 5 培养室日常清洁和消毒管理 5.1 湿度控制 应用空调、空气抽湿机等对培养室的空气湿度控制在50.0％ ～60.0％。 5.2 日常消毒 当天工作结束后用溴氧发生器进行溴氧消毒1 h ～2 h。 5.3 除尘 每周定期用除尘器对培养室的地板吸尘2～3次，以减少环境灰尘累积。 5.4 污染苗清理 每天对组培材料进行观察，发现污染的应立即移出培养室。 5.5 培养架清洁 每批次培养材料转接移开培养架后，应立即清除培养架上的灰尘及渗出的培养基，用75％的乙醇进 行擦拭1次。 6 污染培养容器清洗处理 6.1 污染材料处理 从培养室移出的污染材料在培养容器盖未打开前