65.020.01 ICS B 16 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 2029—2019 甘蔗白条病菌 PCR 检测技术规程 Detecting technique regulations for pathogen of Xanthomonas albilineans (Ashby)Dowson based on PCR 2019 - 12 - 05 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2019 - 12 - 30 实施 发 布 — DB45/T 2029 2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。 本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。 本标准主要起草人员：韦金菊、刘昔辉、覃振强、张小秋、张荣华、桂意云、魏春燕、宋修鹏、李 杨瑞、周珊、黄东亮、颜梅新、刘璐。 I — DB45/T 2029 2019 甘蔗白条病菌 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗白条病菌（Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson）的 PCR 检测的原理、试 剂、主要仪器与设备、样品的采集、保存和运输、检测方法和结果描述及判定。 本标准适用于甘蔗白条病菌[Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson]的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 2008 分析实验室用水规格和试验方法 — 3 原理 利用甘蔗白条病病原白条黄单胞菌16-23rRNA 的ITS基因设计的特异性强的引物XaAlb2-f3和 XaAlb2-r3，以病原菌的DNA为模板，PCR扩增合成目的片段，从而快速、灵敏、高效地对甘蔗白条病菌 （Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson）进行检测。 4 试剂 所用试剂均为分析纯试剂，实验室用水符合 GB/T 6682—2008 中二级水指标，其中涉及 PCR 的用 水应符合一级水指标。 4.2 液氮。 4.3 植物基因组 DNA 提取试剂盒。 4.4 Golden view 核酸染料。 4.5 2 EasyTaq PCR 反应预混液：市售产品。浓度为 10 mmol/L，其中含有 0.05 U/ L Taq DNA Polymerase、0.4 Mm dNTP Mixture、4 mMMg 、2 PCR Buffer。 4.6 1 TE 缓冲液。 4.7 1 500 bp DNA 分子质量标准物。 4.8 琼脂糖，电泳级。 4.9 检测引物序列： ——上游引物 XaAlb2-f3：5 - CACACACACAATACAGCATTGCGG -3 ； ——下游引物 XaAlb2-r3：5 - CCCAACTTACTTGAGGCTATGG -3 ； ——预扩增片段大小为 400 bp 5 bp。 4.10 标样：阳性对照为已确定感染甘蔗白条病菌的样品基因组 DNA；阴性对照为确定未感染甘蔗白条 病菌的样品基因组 DNA。 4.1 μ × 2+ × × ’ ’ ’ ’ ± 1 — DB45/T 2029 2019 5 主要仪器与设备 5.1 PCR 扩增仪。 5.2 成 。 5.3 白分析仪 分 计。 5.4 高速 ： 12 000 以 。 5.5 水 。 5.6 ：2 、-20 、-80 。 5.7 高 菌 。 5.8 。 5.9 ： 0.001 。 5.10 样器：0.1 2. 、0. 10 200 、 0 1 000 。 凝胶 像系统 核酸蛋 或紫外 光光度 台式 冷冻离心机 离心力 g 上 恒温 浴锅 冰箱 ℃～4 ℃ ℃ ℃ 压灭 锅 鼓风干燥箱 电子天平 感量 g 微量加 μL～ 5 μL 5 μL～ μL、2 μL～20 μL、10 μL～100 μL、20 μL～ μL 5 μL～ μL 6 样品的采集、保存和运输 6.1 样品采集 可采集叶片样品或蔗茎样品。叶片取最高可见肥厚带叶（+1叶）中部部位叶片的1.0 g～2.0 g，放 置于样品袋中备用；蔗茎取成熟期甘蔗的中下部茎节，去皮挤汁，取汁液置于5 ml～10 ml离心管中备用。 6.2 样品保存和运输 放置 ℃～ ℃条件下保存，时间≤48 h；长期保存，需放置在-80 ℃条件下，不可反复冻融。 长途 时 温箱中加干冰或液氮密封后运送。 8 样品 于2 运输 ，可采用保 7 检测方法 7.1 样品 DNA 提取 叶 间部 g 冷冻 磨至粉末状，按所选择的植物基因组 DNA 提取试剂 推荐 操作 汁 5 mL 放入 mL 离心管 m 离心 3 min，弃上清，向沉淀加入 1 000μL 灭 m 离心 m 复操作 次 向沉淀加入 20 μL～200 μL 灭菌水。 7.1.1 取 片样品的中 分 0.1 ，用液氮 研 盒 的 方法提取样品 DNA。 7.1.2 取蔗 样品 1. 2 中，13 000 r/ in 菌水，13 000 r/ in 3 in，重 2 ， 7.2 样品 DNA 质量检测 样品DNA提取 扩增。 后，用蛋白/核酸分析仪鉴定样品DNA质量，当A 260 /A280 比值为1.8～2.0时，适合于PCR 7.3 PCR 检测 反 体系 反 体系 各 量 根据反 体系的总体体积进 表 配制 5 μL 当调整 参数 4 ℃预变 4 m ； 4 ℃变 55 ℃退火 5 ℃延伸1 min，进行 个循环； 5 ℃延伸 m 空 无 的PCR扩增 应 ， 应 中 试剂的 可 应 按 1的方法 2 行适 。PCR扩增 ：9 性 in 9 性30 s， 30 s，6 31 6 3 in。 白对照为 菌一级水。 2 — DB45/T 2029 2019 表1 PCR 扩增反应体系参数 试剂 使用量 25 μL反应体系终浓度 2×Easy Taq PCR 反应预混液 12.5 μL 1× XaAlb2-f3（10μmol/L） 1.0 μL 0.8 μmol/L XaAlb2-r3（10μmol/L） 1.0 μL 0.8 μmol/ L 模板DNA(25 ng/μL) 1.0 μL 2 ng/μL 一级水 9.5 μL / 总体积 25 μL / 7.4 扩增产物的电泳检测 称取适量琼脂糖加入 1×TAE 缓冲液中，加热至完全溶解，配制成 1.5％的琼脂糖溶液；稍适冷 却后倒板，室温下凝固成琼脂糖凝胶。 7.4.2 分别取 2 μL 6×上样缓冲液和 5 μL 的 PCR 扩增产物到新的 PCR 管，振荡混匀，2 000 g 离心 5 s。 7.4.3 分别将 5 μL DNA 分子量标准物和 PCR 产物混合液依次加入琼脂糖凝胶的点样孔后进行电泳， 电泳使用的电压为 80 V，电泳时间为 30 min。 7.4.1 7.5 凝胶成像分析 将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪上，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带大小，将电 泳结果用拍照系统拍照形成图片文件存档。 8 结果描述及判定 8.1 质控标准 阳性对照出现一条大小为400 bp±5 bp条带，阴性对照和空白对照无条带时判定为实验有效。 8.2 结果判定 阳性：被检样品泳道出现一条大小为 400 bp±5 bp 条带时，判为阳性，必要时进行测序。 阴性：被检样品没有出现一条大小为 400 bp±5 bp 条带，经重复 2 次 PCR 检测后仍未出现扩增 条带时，判为阴性。 8.2.1 8.2.2 3 中华人民共和国广西地方标准 甘蔗白条病菌 PCR 检测技术规程 DB45/T 2029―2019 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究