ICS 67.050 X 04 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4043—2020 生鲜乳中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2 的测定 液相色谱-柱后光化学衍生法 Detection of aflatoxin B1、B2、G1、G2、M1、M2 contents in raw milk by liquid chromatography with post-column photochemical derivatization 2020 - 07 - 09 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 08 - 09 实施 发 布 DB37/T 4043—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农科院农业质量标准与检测技术研究所、青岛农业大学、青岛农业大学海 都学院。 本标准主要起草人：王玉涛、韩荣伟、于忠娜、蔡达、徐宁、张潇、高磊、赵玉华、刘俊华、秦宏 伟、邱慧玲、王军、盖学武、焦霞、杨永新。 I DB37/T 4043—2020 生鲜乳中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2 的测定 光化学衍生法 液相色谱-柱后 警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光(阳光)，具备相对独立的操作台和废 弃物存放装置。在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。 1 范围 本标准规定了测定生鲜乳中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2含量的液相色谱-柱后光化学衍生测 定方法。 本标准适用于生鲜乳中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的定量测定。 本标准方法的检出限：黄曲霉毒素B1为0.002 μg/kg，黄曲霉毒素B2为0.002 μg/kg，黄曲霉毒素 G2为0.002 μg/kg，黄曲霉毒素G1为0.002 μg/kg，黄曲霉毒素M1为0.005 μg/kg，黄曲霉毒素M2为0.002 μg/kg；本标准方法的定量限：黄曲霉毒素B1为0.006 μg/kg，黄曲霉毒素B2为0.005 μg/kg，黄曲霉 毒素G2为0.005 μg/kg，黄曲霉毒素G1为0.006 μg/kg，黄曲霉毒素M1为0.015 μg/kg，黄曲霉毒素M2 为0.006 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2用甲醇溶液提取，提取液经黄曲霉素毒素免疫亲和柱净 化、富集，用高效液相色谱分离后经柱后光化学衍生，荧光检测器检测，外标法定量。 4 试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水为GB/T 6682中规定的一级水。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 甲醇水溶液：取 50 mL 甲醇，加入 50 mL 纯水，混合均匀。 4.4 流动相：乙腈+水=20+80。分别取 200 mL 乙腈，800 mL 水，混合均匀，并脱气备用。 4.5 黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2、M1、M2）标准储备溶液：采购市售标准溶液，分别用甲醇配成 100 ng/mL 的标准储备液。储备液于-4 ℃避光保存（有效期三个月）。 4.6 免疫亲和柱：柱容量≥100 ng(柱容量、回收率、柱回收率验证方法参见商品说明书)。 注：对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。 1 DB37/T 4043—2020 4.7 滤膜：0.45 μm 有机滤膜。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 液相色谱仪：荧光检测器。 光化学衍生装置。 分析天平，感量 0.01 g。 固相萃取装置。 旋涡混合器。 冷冻离心机：转速不小于 10 000 r/min。 氮吹仪。 6 测定步骤 6.1 提取 称取20 g样品，精确到0.01 g，置于50 mL的离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋5 min，以10 000 r/min 的转速在-5 ℃条件下于冷冻离心机离心10 min，取上清液加水定容至50 mL，备用。 6.2 净化 将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温，待免疫亲和柱内的液体放弃后，将上述样液移至50 mL注 射器筒中，控制流速为1 mL/min～3 mL/min。待样液滴完后，往注射器筒内加入10 mL水，以稳定流速 淋洗免疫亲和柱后，吹干亲和柱。加入2×2 mL乙腈(或甲醇)洗脱亲和柱，控制流速为1 mL/min～3 mL/min，吹干亲和柱，收集全部洗脱液至刻度试管中。在50 ℃下氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用初 始流动相定容至1.0 mL，涡旋30 s溶解残留物，0.45 μm有机滤膜过滤，供液相色谱测定。 6.3 标准曲线配置 用流动相（4.4）将黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2稀释成0.1 ng/mL～10.0 ng/mL的系列标准溶 液。 6.4 测定 6.4.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件列出如下： a) 色谱柱：C18 柱（柱长 250 mm，柱内径 4.6 mm，填料粒径 5 μm）； b) 流动相：乙腈+水（20+80，体积比）； c) 柱温：30 ℃； d) 流速：0.8 mL/min； e) 进样量：20 μL； f) 检测器：荧光检测器； g) 检测波长：EX（激发波长）=355 nm，EM（发射波长）=430 nm。 6.4.2 定量测定 2 DB37/T 4043—2020 根据试样溶液中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的含量情况，选定浓度相近的混合标准工作溶液， 混合标准工作溶液中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的响应值应在仪器检测的线性范围内。对混合标 准工作溶液和试样溶液等体积注入液相色谱仪。按照保留时间进行定性，以标准曲线进行定量测定。标 准品色谱图参见附录A中图A.1。 6.5 空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。 7 试验数据处理 试样中黄曲霉毒素以B1、B2、G1、G2、M1、M2分别计，单位为微克每千克（μg/kg），按下列公式（1） 计算： ................................... (1) 式中：  ——试样中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；  ——从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V ——样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； m ——样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。 计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 8 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20 %。 3 DB37/T 4043—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2 液相色谱图 说明：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2标准溶液浓度分别为3.92 ng/mL、1.02 ng/mL、3.9 ng/mL、1.0 ng/mL、 1.0 ng/mL、1.0 ng/mL。 图A.1 高效液相色谱分离黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2 的标准图谱 _________________________________ 4