ICS 65.020 B 16 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3480—2019 小麦全蚀病的病原检测与病害诊断 技术规程 Technical regulation for detection and identification of Gaeumannomyces graminis 文稿版次选择 2019 - 12 - 25 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 01 - 25 实施 发 布 DB34/T 3480—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农科院植物保护与农产品质量安全研究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农科院植物保护与农产品质量安全研究所、安徽省农业科学院作物研究所、 安徽省霍山县启思生态农业有限公司、宿州市植检植保站、淮南市农业技术推广中心、肥西县农业综合 服务中心、泗县农业技术推广中心、滁州市农业农村技术推广中心、安徽省科技教育中心、安徽省农业 科学院土壤肥料研究所、旌德县农产品质量安全监管局、寿县农业技术推广中心、颍上县农业技术推广 中心、阜南县植保植检站、宿州市埇桥区植检植保站、宿州市农业科学院、临泉县农业技术推广中心、 临泉县韦寨镇农业综合服务站、阜阳市颍州区种子管理站。 本标准主要起草人：赵伟、汪涛、迟元凯、马书芳、朱德慧、王勋、斯黔东、赵友邦、孔令聪、戚 仁德、吴岩松、赵其苍、胡冠麟、殷言军、汪继承、查明方、胡凤桂、徐辉、李绍然、马骥、张培培、 陶玲、王月英、赵振邦、周宗玲、张俊勇、刘玉玲、孙文勤、李娟、王道中。 I DB34/T 3480—2019 小麦全蚀病的病原检测与病害诊断技术规程 1 范围 本标准规定了小麦全蚀病的检测诊断依据、病原的分离纯化与子囊壳诱导、形态学鉴定、分子检测、 回接试验和检测结果判定。 本标准适用于小麦全蚀病的检测诊断。 2 检测诊断依据 2.1 以小麦全蚀病菌引致病害的症状、病菌形态学特征、PCR 反应结果、柯赫氏法则等为病原检测和 病害诊断依据。 2.2 小麦全蚀病菌的形态学特征及其所引致病害的症状参见附录 A。 3 病原的分离、纯化与子囊壳诱导 3.1 培养材料准备 3.1.1 培养基准备 3.1.1.1 基础培养基 其中： ——PDA 培养基：马铃薯 200.0 g，葡萄糖（或蔗糖）20.0 g，琼脂粉 15.0 g～20.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0； ——PD 培养液：马铃薯 200.0 g,葡萄糖（或蔗糖）20.0 g, 蒸馏水 1000 mL，pH 7.0； ——1/2 PD 培养液：马铃薯 100.0 g，葡萄糖 10.0 g，酵母浸提膏 2.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0。 3.1.1.2 选择性培养基 将 PDA 培养基冷却至 45℃～55℃时，向每升培养基加青霉素 50 mg，摇匀后备用。 3.1.2 对照菌株 禾顶囊壳（Gaeumannomyces graminis）标准菌株。 3.2 分离与纯化 选取疑似发病小麦的根部或茎基部，洗净晾干。从病健交界处切 2 mm～3 mm 的小段 15 段～20 段，放入 1％的 NaClO 溶液中浸泡 30 秒，然后用无菌水冲洗 3 次，再至无菌的滤纸上吸干残余水分， 置于选择性培养基上，每皿 3 块～5 块，用封口膜将培养皿封好，置于 25℃恒温培养箱内培养。待菌 丝长出后，从菌落边缘切取菌丝块分别转接到新的基础培养基平板上，备用。 1 DB34/T 3480—2019 3.3 子囊壳诱导 无菌条件下，在纯培养的菌落边缘用打孔器切取直径为 4 mm 的菌丝块，用挑针将菌丝块移植入装 有 30 mL 1/2 PD 培养液的 100 mL 的三角瓶中，使用封口膜将瓶口封好，置于 25℃ 恒温培养箱内培 养 7 天左右，待菌丝长满培养基表面后，将三角瓶取出，置于室内散射光下进行诱导产壳，定期观察 子囊壳的产生情况。 4 形态学鉴定 观察培养 4 天的菌落形态，并沿菌落边缘挑取少量菌丝，置于显微镜下观察菌丝、子囊壳与子囊 孢子的形态，与对照菌株和附录A 描述的形态进行比对、判断。 5 分子检测 5.1 病原菌基因组的提取 5.1.1 分离培养物 DNA 的提取 将纯培养的分离物在 PD 培养液中培养 7 天，抽滤收获菌丝体，用无菌水冲洗 1 次～2 次，并用 无菌吸水纸吸去多余水分。将获得菌丝移于灭菌研钵内，加液氮研磨至粉末状后转移到 1.5 mL 的离心 管中。用基因组 DNA 提取试剂盒或提取试剂按 CTAB 法提取菌丝 DNA，CTAB 法参见附录B。 5.1.2 病样 DNA 的提取 切取约 10 mm 的发病组织，移于灭菌研钵内，加液氮研磨至粉末状后转移到 1.5 mL 的离心管中。 用基因组 DNA 提取试剂盒或提取试剂按 CTAB 法提取菌丝 DNA，CTAB 法参见附录B。 5.2 PCR 检测 以 5’-GTCAACGACAGGACTAACGC -3’ 和 5’-GACCGGTTCACCATGCTGCTC -3’ 为特异性引物，每 25 μL PCR 反应体系包括 1 μL 基因组 DNA，0.5 μM 引物，50 μM dNTP，2.5 μL 10× PCR 反应缓冲液（100 m M Tris-HCl pH 8.3，500 mM KCl，15 mM MgCl2），和 1.25 U TaqDNA 酶，用灭菌超纯水定量到 25 μL。 热循环反应参数为：94℃预变性 5 分钟，然后经 94℃ 30 秒，58℃ 30 秒，72℃ 30 秒，35 个 循环；最后 72℃延伸 7 分钟。用对照菌株基因组作为阳性对照，用无菌水作为阴性对照。 5.3 PCR 结果判定 反应结束后取 PCR 扩增产物 5 μL 上样于 1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出 508 bp 单一条带的 为阳性结果。 6 回接实验 6.1 将土与沙子按照 3:1 体积比进行混合，灭菌后，装入直径 15 cm 的盆钵中，装至距盆钵上沿约 1/4 的位置。将分离纯化的菌株在 PDA 培养基上培养 7 天后，切取 1 cm×1 cm 的菌丝块 10 片，平 铺放在栽培基质上。 6.2 播入催芽露白的小麦种子，每钵 10 粒，在每个小麦种子旁边放置两个病麦粒，然后在上面覆盖 一层厚约 0.5 cm 的无菌沙土，然后将盆钵放置于白色塑料托盘中。置于温度为 25℃，光照周期为 16 2 DB34/T 3480—2019 小时光照、8 小时黑暗的条件下培育，保持土壤湿润 6 天～8 天，拔起后观察根部是否发病、病害症 状是否属典型的小麦全蚀病症状。 6.3 接种发病后，再从病健交界处重新按 3.2 进行分离培养，观测其形态学性状与接种物是否相同。 7 检测结果判定 经形态学观测，与对照菌株和附录A 描述的形态进行比对，根据相似性判定其是否属于全蚀病菌； 经 PCR 扩增，如能扩增出 508bp 单一条带，则认为该分离物系小麦全蚀病菌；通过回接实验，如回接 后产生典型的小麦全蚀病症状，且从回接后的发病部位分离到与之前一样的分离物，则最终判定为小麦 全蚀病菌，即该病害为小麦全蚀病。 3 DB34/T 3480—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 小麦全蚀病菌形态描述及其引致病害的典型症状 A.1 小麦全蚀病菌形态 病菌的匍匐菌丝粗壮，栗褐色，有隔。老化菌丝多呈锐角分枝，分枝处主枝与侧枝各形成一隔膜， 呈现“∧”。匍匐菌丝 3～4 根聚集在一起，在寄主根茎和叶鞘表面形成网纹，在根部多与根轴平行生长。 分支菌丝淡褐色，形成 2 类附着枝：一类瓣状，褐色，顶生与侧枝上；另一类简单，圆筒状，淡 褐色，顶生或间生。附着枝端部产生侵入丝，侵入寄主。多数简单附着枝聚生，形成菌核状菌丝垫，直 径 20 μm以上。子囊壳黑色，球形或梨形，顶部有一稍弯的颈。子囊无色，棍棒状，其大小 70～100 μm×10～15 μm（不包括子馕柄），子囊内有 8 个平行排列的子囊孢子。子囊孢子无色，线状稍弯曲， 大小 60～90 μm×3～5 μm，有 3～8 个横隔膜。在 PDA 培养基上，菌落初白色，后变灰色和黑色，气 生菌丝灰色，短而密集。菌落边缘的菌丝有反卷现象，菌落中有疏密不等的菌丝束。 病菌在培养中可产生无色单胞的瓶梗孢子，有两种类型：一类弯曲呈新月型，不能发芽；另一类卵 形至圆柱形，直或稍弯，可以发芽。某些菌株在培养中还产生念珠状的细胞、厚垣孢子和微菌核。 A.2 小麦全蚀病典型症状 小麦全蚀病菌只侵染小麦根部及茎基部 1～2 节。小麦出苗 3 天即可受到侵染，出苗后 5 天～10 天侵染即达高峰，幼苗期病原菌主要侵染根和地下茎，使之变黑腐烂，症状主要表现为：病株矮小，根 基部分叶片发黄，心叶内卷，自下而上似干旱缺肥状，分蘖减少，生长衰弱，严重时死亡，病苗返青推 迟，矮小稀疏，种子根和地下茎变成灰黑色，严重时次生根也会变成黑色，造成麦苗连片枯黄和枯死的 症状。 拔节期的冬麦病苗主要表现为：分蘖较少、返青迟缓，病株根部大范围变黑的现象。在茎基部和叶 鞘内侧出现较明显的灰黑色病菌菌丝层，叶片自下向上逐渐褪绿发黄；抽穗之后田间病株成簇或者点片 状发生早枯白穗，病根变黑现象，并易于拔起；灌浆成熟期发病症状最为明显，在此期间症状主要表现 为：病株变矮、褪色，生长参差不齐，在生长整齐的健康植株中会出现生长不一致，叶色以及穗色深浅 不同的矮化发黄的病区。 潮湿是黑色菌丝层紧密的交织在茎基表面以及叶鞘内侧，呈“黑脚”状，这是全蚀病区别于其他根 腐病的典型症状。重病株地上部明显矮化，发病晚的植株矮化不明显。在潮湿情况下，小麦近成熟时在 病株基部叶鞘内侧生有黑褐色颗粒状突起，颜色加深呈现“黑膏药”状，即病原菌的子囊壳。但在干旱 条件下，病株基部“黑脚”症状不明显，也不产生子囊壳。由于茎基部发病，植株早枯形成“白穗”。 田间病株成簇或点片状分布，严重时全田植株枯死。 4 DB34/T 3480—2019 BB 附 录 B （资料性附录） CTAB 法提取 DNA 将菌丝进行低温冷冻干燥处理（﹥24 小时），保存在 -20℃待用； 2) 取 0.1 g～0.2 g 丝于 1.5 mL～2 mL 的离心管中，用玻璃棒将干燥后的菌丝充分碾碎； 3) 加入 0.6 mL～1 mLCTAB 提取缓冲液，充分振荡之后置 70℃水浴中静置 30 分钟； 4) 15000×g 高速离心 10 分钟，吸取上清液至在 1.5 mL 离心管中； 5) 在上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），振荡混