ICS 11.020 C 62 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.2—2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 2 部分：病毒分离与鉴定 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 2: Virus isolation and identification 2020 - 03 - 02 发布 江苏省市场监督管理局 2020 - 03 - 03 实施 发 布 DB32/T 3762.2—2020 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估。 本部分为DB32/T 3762 的第2部分。 本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：迟莹、朱宝立、葛以跃、郭喜玲、崔仑标、程军平、徐佳南、钱志远、罗晓明、 沈欢喜。 I DB32/T 3762.2—2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 2 部分：病毒分离与鉴定 1 范围 本部分规定了新型冠状病毒感染临床样本病毒分离培养环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操 作步骤和清场与消毒。 本部分适用于新型冠状病毒感染患者各类临床样本中新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的分离培养， 其它呼吸道病毒的分离培养程序可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 细胞病变效应 cytopathic effect，CPE 病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引 起其显微表现改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体，乃至 细胞裂解等即细胞病变效应。 4 环境与设施 4.1 实验室资质及级别要求：应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，实验室开展新型 冠状病毒感染临床样本病毒分离培养相关活动前，应报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资 质，并需在生物安全三级（BSL-3）实验室进行。 4.2 操作人员资质及防护要求：实验操作人员应经过生物安全培训并取得 BSL-3 实验活动上岗证，在 身体健康状态良好的情况下准入。操作人员按 BSL-3 级实验室个人防护的要求进行防护，需配备 N95 及以上级别防护口罩、护目镜或防护面屏、连体防护服、一次性手术衣、一次性 PE 手套、乳胶手套、 鞋套、靴套等防护装备。 5 设备与耗材 5.1 设备 生物安全柜、离心机、倒置显微镜、涡旋器、CO2培养箱等。 1 DB32/T 3762.2—2020 5.2 耗材 一次性平皿、剪刀、镊子、聚四氟乙烯研磨器（塑料）、离心管、细胞培养瓶/细胞管、移液器、 移液管、带滤芯Tip头等。 6 试剂与材料 6.1 临床样本 6.1.1 呼吸道样本：咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等。 6.1.2 尸体解剖组织样本。 6.1.3 血液样本：病人急性期血清。 6.2 试剂 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 Hanks 溶液（每毫升含青、链霉素各 2000 单位）。 DMEM 培养液（含 10%胎牛血清）。 DMEM 维持液（含 2%胎牛血清）。 消化液 （0.25%胰酶和 0.025% EDTA-Na2 混合液）。 6.3 细胞 非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）、人肝癌细胞（Huh7）等。 7 操作步骤 7.1 实验前准备 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.1.4 将实验所需细胞置 37℃ 5% CO2 培养箱培养至单层。 配备消毒液：75%酒精、0.55%次氯酸钠消毒液。 检查 BSL-3 级实验室压力是否正常。 将细胞、样本、试剂和耗材一次性带入 BSL-3 级实验室核心区。 7.2 样本处理 7.2.1 呼吸道样本及肛拭子 a) 在生物安全柜内涡旋震荡装有呼吸道样本（咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等）及肛拭子的采样 管，瞬时离心后取上清液至新的离心管，按终浓度 10%～20%加入青链霉素，置 4℃冰箱处理 样本 4-6 小时或过夜。 b) 将上述处理过的样本 4℃，4000rpm，离心 5min，以去除杂质。 7.2.2 肺组织样本 a) 在生物安全柜内将肺组织放在平皿内，取 3 mL～5mL 的 Hanks 溶液漂洗 3 次，以去除组织外 部的血垢。漂洗时动作要轻柔，防止气溶胶的产生和液体的溅出。漂洗的废液收集在含 0.55% 的次氯酸钠消毒液的带盖塑料瓶内。 b) 将漂洗后的肺组织，用无菌的剪刀和镊子去除肺组织上的结缔组织和血管，再用 Hanks 溶液 漂洗 1 次，将肺组织剪成 1mm3 的小块放在研磨器内进行研磨，研磨的动作要轻柔，注意避免 2 DB32/T 3762.2—2020 液体的溅出。研磨后制成 20%悬液，按终浓度 10%～20%加入青链霉素，置 4℃冰箱处理样本 4-6 小时或过夜。 c) 将上述处理过的样本管 4℃，4000rpm，离心 5min，以去除杂质。 7.2.3 血液样本 a) 感染急性期血清，按终浓度 10%～20%加入青链霉素，置 4℃冰箱处理样本 4～6 小时或过夜。 b) 将上述处理过的样本管 4℃，4000rpm，离心 5min，以去除杂质。 7.3 接种病毒 7.3.1 弃去 VERO-E6 细胞培养液，用 Hanks 液洗涤细胞 3 次，弃上清。 7.3.2 吸取 50μL～200μL 样本液接种至培养孔内，轻轻混匀，置 37℃ 5% CO2 培养箱，吸附 1h～2h， 期间每 15min 摇晃一次。 7.3.3 吸附后弃上清，补足适量 DMEM 维持液，置 37℃ 5% CO2 培养箱培养，设 VERO E6 细胞对照 7.4 细胞病变（CPE）观察与培养物收集鉴定 7.4.1 细胞病变（CPE）观察 按上述方法样本接种细胞后，每24h在倒置显微镜下观察细胞形态变化（CPE）：以0%～25%细胞 CPE变化为“+”，26%～50%细胞CPE变化为“++”，51%～75%细胞CPE变化为“+++”，76%～100%细胞 CPE变化为“++++”，正常细胞形态为“-”。 7.4.2 培养物收集 每代次收集的培养物需反复冻融三次，4℃，4000rpm，离心15min，收集上清。 7.4.3 培养结果鉴定 满足以下两点判定病毒分离成功。若不满足以下条件说明病毒分离不成功，需盲传三代或重新接种 临床样本再做鉴定。 a) 样本接种孔细胞出现明显 CPE(+及以上)； b) 分离培养物进行新型冠状病毒核酸检测呈阳性。 8 清场与消毒 8.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用 75％酒精擦拭外表面后，移出生物安全柜。 8.2 将实验过程产生的所有污染材料经 121℃，30min 高压消毒灭菌处理。 8.3 用新鲜配制的含 0.55％次氯酸钠溶液擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，不要擦拭顶棚，作 用 30min 后，用清水擦拭以除去残余消毒液。 8.4 填写实验记录并用传真机传出，退出核心区填写 BSL-3 级实验室相关实验记录。 _________________________________ 3