ICS 65.120 B 46 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3474—2019 饲料中黄芩苷的测定 高效液相色谱法 Determination of baicalin in feeds - High performance liquid chromatography 文稿版次选择 2019 - 12 - 25 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 01 - 25 实施 发 布 DB34/T 3474—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽安丰堂动物药业有限公司、安徽省兽药饲料监察所、东至县畜牧兽医局、安 徽省动物疫病预防与控制中心、阜阳市动物卫生监督所。 本标准起草人：刘发全、何宗来、周宏华、谢军池、明文庆、陈文帮、王群、丁常宏。 I DB34/T 3474—2019 饲料中黄芩苷的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中黄芩苷含量测定的高效液相色谱法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中黄芩苷含量测定。 本方法检测限为 1.0 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样中的黄芩苷用甲醇水溶液超声提取，经离心、过滤后的试样溶液注入高效液相色谱系统中进行 分离，用紫外检测器检测，外标法计算黄芩苷的含量。 4 试剂和材料 4.1 除特殊说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合 GB/T 6682 中一级用水规定。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 乙腈：色谱纯。 4.4 甲醇水溶液：50％（V+V)。 4.5 磷酸。 4.6 流动相 A：磷酸溶液（0.025 mol/L）。 4.7 流动相 B：乙腈。 4.8 黄芩苷：CAS 号 21967-41-9，纯度 ≥98.0％。 4.9 黄芩苷标准溶液的制备 4.9.1 黄芩苷标准溶液贮备液：精确称取 20 mg 黄芩苷标准品(精确至 0.01 mg)于 200 mL 容量瓶中， 用流动相（4.6）溶解，冷却，此溶液浓度为 100 μg/mL。置于 4℃冰箱中保存，有效期 60 天。 4.9.2 黄芩苷标准工作溶液：分别吸取贮备液（4.9.1）1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL 于 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，标准工作溶液系列浓度分别为 1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL。 5 仪器和设备 1 DB34/T 3474—2019 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 高效液相色谱仪(配紫外检测器)。 分析天平：感量 0.1 mg、0.01 mg。 离心机：≥3000 r/min。 超声波仪。 分析筛：孔径 0.42 mm。 粉碎机。 微孔滤膜：孔径 0.45 μm 尼龙滤膜。 试样的制备 按 GB/T 14699.1 的规定采样，选取有代表性饲料样品 500ｇ以上，四分法缩减至 100ｇ；按 GB/T 20195 的规定制备样品，磨碎，全部通过分析筛(5.5)，混匀，装入磨口瓶中备用。 7 分析步骤 7.1 试样的提取 7.1.1 称取试样适量（配合饲料 5.0 g、浓缩饲料 3.0 g、预混合饲料 1.0 g），精确至 0.001 g，置 于 100 mL 磨口三角烧瓶中，准确加入甲醇溶液（4.4）50 mL，置于超声波仪（5.4）超声提取 30 min。 7.1.2 取试样提取液（7.1.1）20 mL 转移至离心管，3000 r/min，离心 10 min，取离心上清液 2 mL， 用 0.45 μm 尼龙滤膜过滤，滤液作为试样溶液上机测定，同时进行两份平行试验。 7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 7.3 参考色谱条件 色谱柱：C18 型柱，长 250 mm，内径 4.6 mm，粒径 5 μm，或相当性能 C18 柱； 检测波长：277 nm； 流动相：A：磷酸溶液（0.025 mol/L）B：乙腈，梯度淋洗，见表 1； 流速：1.0 mL/min； 柱温：室温； 进样体积：20 μL。 测定 黄芩苷标准工作溶液(4.9.2)和试液（7.1.2）分别进样得到色谱峰面积响应值，按表1 进行高效液 相色谱淋洗梯度洗脱，在线性范围内，用外标法校正，测定，以保留时间定性，峰面积定量。 黄芩苷标准色谱图参见附录A 中图A.1。 表1 2 流动相梯度淋洗表 时间/min A：磷酸溶液/％ B：乙腈/％ 0.00 84.0 16.0 12.00 84.0 16.0 16.00 68.0 32.0 23.00 68.0 32.0 27.00 84.0 16.0 30.00 84.0 16.0 DB34/T 3474—2019 7.4 结果的计算与表述 7.4.1 计算公式 结果按式(1)计算： ............................... (1) 式中： ——试样中黄芩苷含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； ——试液色谱峰对应的黄芩苷浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； ——试样质量，单位为克（g）； ——定容体积，单位为毫升（mL） f ——稀释倍数。 X C m V 7.4.2 结果表示 平行测定 2 次，结果用算术平均值表示，计算结果保留 3 位有效数字。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10％。 3 DB34/T 3474—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 黄芩苷标准溶液的液相色谱图 图A.1 黄芩苷标准溶液液相色谱图 _________________________________ 4