ICS 65.020.99 B 05 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3487—2019 水稻品种选育花药培养快速纯合技术 Rapid homozygous technique of anther culture for rice variety selection 文稿版次选择 2019 - 12 - 25 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 01 - 25 实施 发 布 DB34/T 3487—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量和标准化研究院提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：合肥丰乐种业股份有限公司、安徽省农业科学院水稻研究所。 本标准主要起草人：徐丽媛、吴晓亮、周桂林、冯睿彤、丛夕汉、周贤达、黄书伟、范家萌、周红 英、董伟、徐四静、夏泽静、徐晓莉、胡娜、高守宜、王笑见、谭娟、王兆贤、王浩波。 I DB34/T 3487—2019 水稻品种选育花药培养快速纯合技术 1 范围 本标准规定了水稻品种选育花药培养快速纯合技术的术语和定义、培养流程及操作程序。 本标准适用于水稻（籼稻、粳稻、籼粳交）杂合世代材料的快速纯合选育。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 2306 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 水稻花药培养快速纯合技术 Rapid homozygous technique of Rice Anther Culture 利用植物细胞全能性，对单核靠边期的水稻花药进行培养，通过适宜的愈伤诱导、分化、生根培养 基培养成苗，并自然加倍成为纯合二倍体植株，快速得到纯合水稻单株，提高育种效率。 4 技术流程图 见图1。 图1 5 流程图 培养条件 水稻花药培养各阶段培养条件见表1。 1 DB34/T 3487—2019 表1 水稻花药培养各阶段培养条件 温度 湿度 光强 光照时间 （℃） （％） （lux） （h/d） 愈伤诱导（暗培养） 25±1 50-60 0 0 分化、生根（光培养） 28±1 55-65 1500-3000 14 培养阶段 6 培养基组分用量及配制方法 6.1 培养基组分用量 水稻花药培养各阶段使用培养基组分及用量见表2。 表2 试剂名称 用量（mg/L） 诱导愈伤培养基 分化培养基 生根培养基 (NH4)2SO4 201 -- -- NH4NO3 -- 1650 825 KNO3 2320 1900 950 CaCl2·2H2O 166 440 220 MgSO4·7H2O 255 370 185 KH2PO4 700 170 85 FeSO4•7H2O 42 27.8 27.8 Na2•EDTA 62 37.2 37.3 MnSO4•4H2O 12 22.3 11.15 ZnSO4•7H2O 3 8.6 4.3 H3BO3 6.2 6.2 3.1 KI 0.83 0.83 0.415 Na2MoO4•2H2O 0.25 0.25 0.25 CuSO4•5H2O 0.025 0.025 0.025 CoCl2•6H2O 0.025 0.025 0.025 甘氨酸 5.0 2.0 -- 盐酸硫胺素 B1 2 0.1 0.1 盐酸吡哆醇 B6 1 0.5 0.5 烟酸 1.5 0.5 0.5 肌醇 - 100 100 2,4-D 2.0 -- -- KT 1.0 2.0 -- NAA 2.0 0.5 0.25 蔗糖 60000 30000 30000 琼脂粉 6000 6000 5000 pH 5.8 5.8 5.8 注：“-”表示不需要添加。 2 培养基组分及用量 DB34/T 3487—2019 6.2 配制及分装 6.2.1 使用去离子水溶解蔗糖，按表 2 培养基组分用量要求依次加入相关试剂，待培养基内所有组分 充分溶解后，使用容量瓶定容，并用 pH 计测试 pH 值并调节至 5.8，最后加入琼脂粉，整个过程持续 进行磁力搅拌。 6.2.2 将搅拌好的培养基分装在培养瓶内封口后进行高压蒸汽灭菌，诱导愈伤培养基在 100 ml 培养 瓶内分装 25 ml，分化培养基在 100 ml 培养瓶内分装 50 ml，生根培养基在 3 cm 直径试管内分装 25 ml。 6.2.3 灭菌应符合 NY/T 2306 的规定。 6.3 培养基的存放 6.3.1 灭菌结束后，将培养基放在无菌室内进行冷却，冷却后标明培养基的配制日期，按培养基类型 和配制时间依次放好。 6.3.2 灭菌后的培养基在培养室放置 3 d，观察无污染现象再使用，每次配制的培养基需在 14 d 内 用完。 7 7.1 材料选择及处理 培养材料的选择 7.1.1 田间取材使用显微镜镜检所需水稻花药材料，显示花粉母细胞处于单核靠边期方可进行培养。 外观观察以稻苞抽出叶枕距长短进行取材。 7.1.2 不同类型水稻长短不同，例如一季稻，籼稻在稻苞抽出叶枕距 15 cm 左右，粳稻在 12 cm 左 右，籼粳交材料在 12 cm～15 cm 之间。 7.2 取材时间 取材时间一般在晴天上午 9:00～12:00 之间，可根据当天天气情况和材料类型调整时间。 7.3 预处理 首先登记所取稻苞品种信息、编号，其次对稻苞进行表面清洁，最后使用湿纱布包好按顺序放在冰 箱内进行低温预处理，预处理温度 6～10℃，处理时间为 7～10 d。 7.4 幼穗灭菌 从完成预处理的稻苞中取出幼穗，直接将幼穗放入有盖容器中，倒入 75％酒精浸没幼穗，静置 30 s 后将酒精倾去，继续使用浓度为 0.1％的升汞浸没幼穗，静置 10 min 后取出，使用无菌水冲洗 3 次， 幼穗转移无菌干燥瓶内。 7.5 实验室生物安全 应按照 GB 19489 的规定执行。 8 8.1 培养流程 花药转接方法及每瓶转接量 3 DB34/T 3487—2019 8.1.1 转接过程在无菌操作台上进行，每个培养瓶内转接 100～150 枚花药，转接后标明转接日期和 材料编号。 ——籼稻花药转接流程：使用镊子将水稻颖壳分开，夹取花药直接放入诱导培养基上。 ——粳稻花药转接流程：距颖壳基部 1/5 位置处剪断，用镊子夹住颖壳，将花药倒入诱导培养基 上。 8.1.2 籼粳交材料按照材料偏籼或者偏粳情况从上述两种方法中选择一种进行操作。 8.2 愈伤组织培养 将接好花药的培养瓶放在暗培养室内进行培养，静置培养至愈伤组织生长为直径 3 mm 以上。 8.3 分化培养 在无菌操作台上将直径 3 mm 以上愈伤组织挑取至分化培养基内，每个培养瓶内转接 4～5 枚愈伤 组织。瓶身标明材料编号，放入光照培养室内进行分化培养。 8.4 生根培养 使用镊子将分化至 5 cm 以上的无根幼苗转接至生根培养基，每个试管中转接 1 株幼苗，瓶身标 明材料编号，放入光照培养室进行生根培养。 8.5 炼苗 将主根长至 2 cm 以上的幼苗从培养基中取出洗净，将幼苗放入含营养土的营养钵中，自然阴凉环 境炼苗 2 周，按需补充水分，至幼苗长出新的根系。 9 移栽筛选 9.1 移栽过程按照正常水稻幼苗田间移栽方法进行，田间花培苗抽穗期进行单穗套袋自交，长至成熟 期进行筛选。 9.2 对长势、结实正常单株继续利用，淘汰结实差，畸形穗，矮化株，不育等类型的单株。 10 倍性鉴定与纯系利用 10.1 经过田间筛选得到的花药培养种子进行单穗收获。 10.2 第二代材料穗行种植，通过显微镜鉴定材料倍性，选择正常二倍体材料，并根据田间表现对可用 穗行进行扩繁利用。 _________________________________ 4